| В ПОМОЩЬ МОЛОДОМУ
УЧИТЕЛЮ Ваш профессионализм |
Исследовательская работа учащихся
по теме “Ферменты”
Исследовательская и проектная деятельность школьников стала неотъемлемым атрибутом современной школы. По итогам этого вида деятельности учащихся ежегодно проводятся конференции разных уровней. Спектр исследований и проектов очень широк, но часто эта работа носит реферативный, теоретический характер. Одна из причин – ограниченные возможности школьного кабинета химии. Однако есть направления исследований, которые вполне можно реализовать в скромно оснащенной школьной лаборатории. Одно из таких исследований – изучение ферментативных реакций и свойств ферментов*. Прекрасным объектом исследования служит фермент уреаза. Это вещество содержится в семенах сои, арбуза и других растений, откуда хорошо извлекается, опыты с ним не требуют особой подготовки. Единственное условие работы с ферментами – чистая посуда. Мельчайшие частицы биологического материала искажают результаты эксперимента. Поэтому после проведения каждого опыта посуда должна быть тщательно вымыта. Материал данной статьи рекомендуется, в первую очередь, учителям химии, реализующим авторские программы О.С.Габриеляна на базовом и профильном уровнях. Изучение ферментов предусмотрено Стандартом среднего (полного) общего образования, поэтому некоторые из предложенных опытов можно демонстрировать и при изучении темы “Белки” школьного курса, а часть опытов можно провести в виде лабораторной или практической работы. * Ферменты – белки, органические катализаторы, регулирующие химические реакции в живых организмах. Основные функции ферментов – ускорять превращение веществ, поступающих в организм и образующихся в процессе метаболизма. Уреаза была первым ферментом, выделенным в чистом виде Дж.Самнером в 1926 г. |
Опыт 1. Качественная реакция на фермент уреазу
(Ферментативное разложение мочевины)
Уреаза относится к классу гидролитических ферментов группы амидаз. Реакция, катализируемая уреазой, протекает следующим образом:
H2N–CO–NH2 + H2O = 2NH3 + CO2.
Цель работы. Провести разложение мочевины в присутствии фермента уреазы.
Оборудование и реактивы. Фарфоровая ступка и пестик, мерный цилиндр, пробирки (2 шт.), арбузные семечки (4–5 шт.), вода дистиллированная, мочевина (1%-й раствор), фенолфталеин (0,1%-й спиртовой раствор).
Методика проведения опыта
1) Разотрите в ступке очищенные от кожуры арбузные семечки с 10 мл воды до получения однородной суспензии.
2) Перелейте полученную суспензию в две пробирки.
3) В первую пробирку налейте 5 мл раствора мочевины, во вторую – 5 мл дистиллированной воды.
4) В каждую из пробирок добавьте по 2–3 капли спиртового раствора фенолфталеина.
5) Содержимое пробирок перемешайте.
6) Отметьте происходящие изменения.
Результаты. Опишите свои действия и наблюдения. Объясните результаты опыта.
Выводы. Сформулируйте выводы. Используйте результаты опыта для записи выводов.
С помощью данного метода можно определять не только наличие уреазы, но и содержание мочевины в различных объектах. Разработаны многочисленные методы определения мочевины в крови, моче и других биологических жидкостях, в основе которых лежит данная биохимическая реакция. В качестве объектов исследования в школе можно выбрать почву, воду из плавательных бассейнов, жевательные резинки. Последние интересны тем, что их использование позволяет значительно снизить кислотность в ротовой полости. В слюне, зубном налете имеется большое количество микроорганизмов, влияющих на кислотно-основное состояние в полости рта в норме и при патологии. Некоторые микроорганизмы образуют уреазу, вызывающую гидролиз мочевины с образованием аммиака. Аммиак связывает ионы Н+ с образованием иона аммония, что ведет к подщелачиванию ротовой жидкости.
Одни производители жевательных резинок в качестве нейтрализующего средства используют гидрокарбонат натрия, другие – мочевину (карбамид). Поэтому ученикам можно предложить определить наличие мочевины в жевательных резинках различных марок с помощью ферментативной реакции.
Статья подготовлена при поддержке сервиса «repetitor.org.ua». Если вы решили подтянуть свои знания в области химии, то оптимальным решением станет посетить сервис «repetitor.org.ua». Перейдя по ссылке: «репетитор по химии», вы сможете, не отходя от экрана монитора, связаться с репетитором. Более подробную информацию о ценах и акциях действующих на данный момент вы сможете найти на сайте www.repetitor.org.ua.
При достаточном уровне подготовки можно предложить учащимся провести данное исследование самостоятельно (без использования готовых инструкций).
Опыт 2. Определение мочевины в жевательных резинках
Цель работы. Определить наличие мочевины в жевательных резинках.
Оборудование и реактивы. Фарфоровая ступка и пестик, фарфоровая чашка, мерный цилиндр, пробирка, арбузные семечки (2–3 шт.), вода дистиллированная, пакетик с жевательной резинкой, фенолфталеин (0,1%-й спиртовой раствор).
Методика проведения опыта
1) Разотрите в ступке очищенные от кожуры арбузные семечки с 5 мл воды до получения однородной суспензии.
2) Перелейте полученную суспензию в пробирку.
3) Приготовьте вытяжку из жевательной резинки. Для этого положите измельченную резинку в фарфоровую чашку, налейте 5–7 мл горячей дистиллированной воды. Для лучшей экстракции перемешивайте содержимое. Охладите смесь до комнатной температуры.
4) Полученную вытяжку налейте в пробирку с суспензией арбузных семян.
5) Прилейте к содержимому пробирки несколько капель раствора фенолфталеина и перемешайте.
6) Отметьте происходящие изменения.
Результаты. Оформите в виде таблицы.
Выводы. Сформулируйте выводы.
Уреаза обнаружена в бактериях, в семенах многих растений, особенно бобовых, а также у ряда беспозвоночных; в организме животных, у которых в качестве продукта азотистого обмена образуется мочевина, уреаза отсутствует. Однако в преджелудках жвачных животных уреаза выделяется микроорганизмами и способствует переработке мочевины, вводимой с кормами.
В качестве патогенного организма в желудке человека встречается бактерия Хеликобактер пилори (Helicobacter pylori). Она также вырабатывает уреазу. Пятнадцать лет тому назад исследователи обнаружили в организме человека чрезвычайно любопытную бактерию. Она привлекла к себе внимание тем, что местом ее обитания служит желудок, в котором теоретически не может выживать ни один микроорганизм из-за высокой концентрации соляной кислоты. А эта бактерия не просто существует в таких условиях, но и беспрерывно ведет свою “подрывную деятельность”. Она дезорганизует работу желудка, виновна в появлении язв и гастритов, которые в ее присутствии могут привести к более страшным, необратимым последствиям. В 1994 г. Всемирная организация здравоохранения занесла Хеликобактер пилори в разряд канцерогенов первого класса. А как можно обнаружить эту бактерию? Ученые разработали несколько методов обнаружения.
Экспресс-тест основан на определении активности фермента уреазы в биоптате (материал, полученный путем биопсии). Биоптат слизистой оболочки желудка сразу подвергается исследованию. Цветовая реакция, развивающаяся в геле через 1–2 или 30 мин., указывает на наличие или отсутствие уреазной активности в биоптате. Helicobacter pylori содержит большое количество уреазы, которая гидролизует мочевину до аммония (NH4+). Образование иона аммония регистрируется изменением цвета индикатора, присутствующего в геле.
Несколько лет назад на Западе стали использовать другой прием для определения наличия в желудке человека болезнетворной бактерии – уреазный дыхательный тест. Суть его в следующем. При наличии бактерии Хеликобактер пилори в желудке синтезируется фермент уреаза, который отсутствует у здорового человека. Пациенту дают выпить слабый раствор мочевины, обогащенной природным нерадиоактивным нуклидом углерода C13. В присутствии бактерии мочевина под действием уреазы разлагается на углекислый газ и аммиак. Аммиак реагирует с кислотой желудочного сока, а углекислый газ попадает в кровь и выводится из организма через легкие. При этом в выдыхаемом пациентом воздухе увеличивается содержание C13. При отсутствии бактерии мочевина не разлагается, и никаких изменений в составе выдыхаемого воздуха не происходит.
Опыт 3. Определение фермента уреазы в различных растительных объектах
Цель работы. Определить наличие фермента уреазы в различных растительных объектах.
Оборудование и реактивы. Фарфоровая ступка и пестик, мерный цилиндр, пробирки (2 шт.); вода дистиллированная, мочевина (1%-й раствор), фенолфталеин (0,1%-й спиртовой раствор), соевые бобы, семена дыни, семена огурцов, семена кабачков, рисовая мука.
Методика проведения опыта
1) Разотрите в ступке очищенные от кожуры семечки (бобы или муку) с 5 мл воды до получения однородной суспензии.
2) Перелейте полученную суспензию в пробирку.
3) В пробирку налейте 5 мл раствора мочевины.
4) Добавьте 2–3 капли спиртового раствора фенолфталеина.
5) Содержимое пробирок перемешайте и оставьте при комнатной температуре на 15–20 мин.
6) Отметьте происходящие изменения.
Результаты. Занесите результаты эксперимента в таблицу.
Таблица
| Растительные объекты | Соевые бобы | Семена дыни | Семена огурцов | Семена кабачков | Рисовая мука |
| Наличие уреазы |
Выводы. Сформулируйте выводы. Используйте результаты опыта для записи выводов.
Кроме общих свойств, присущих всем катализаторам, для ферментов характерны специфические свойства, отличающие их от химических катализаторов. Одно из них – высокая специфичность действия. Это означает, что фермент катализирует превращение вещества мочевины в аммиак и углекислый газ и не действует на другие вещества, даже очень схожего строения, например на тиомочевину. Формула последней очень похожа на формулу мочевины и отличается от нее лишь тем, что вместо атома кислорода в молекуле имеется атом серы: H2N–CS–NH2.
Опыт 4. Специфичность фермента уреазы
Цель работы. Экспериментально показать отсутствие каталитической активности уреазы при гидролизе тиомочевины.
Оборудование и реактивы. Фарфоровая ступка с пестиком, мерный цилиндр, пробирка (1 шт.); арбузные семечки (2–3 шт.), вода дистиллированная, тиомочевина (1%-й раствор), фенолфталеин (0,1%-й спиртовой раствор).
Методика проведения опыта
1) Разотрите в ступке очищенные от кожуры арбузные семечки с 5 мл воды до получения однородной суспензии.
2) Перелейте полученную суспензию в пробирку.
3) В пробирку налейте 5 мл раствора тиомочевины.
4) Долейте 5 мл воды и добавьте по 2–3 капли спиртового раствора фенолфталеина.
5) Содержимое пробирки перемешайте и оставьте при комнатной температуре на несколько минут.
6) Отметьте происходящие изменения.
Результаты. Опишите свои действия и наблюдения. Объясните результаты опыта.
Выводы. Сформулируйте выводы. Используйте результаты опыта для записи выводов.
При отсутствии в школьном кабинете химии тиомочевины можно предварительно получить ее из роданида аммония. Роданид (тиоцианат) аммония при нагревании частично изомеризуется в тиомочевину.
Получение тиомочевины
Синтез проводят в вытяжном шкафу.
В фарфоровую чашку помещают 5–6 г роданида аммония и нагревают на открытом пламени спиртовки, пока не образуется пузыристая желтая масса и не начнется бурное выделение аммиака, сероуглерода и сероводорода. Температура при этом не должна превышать 170 °С. Реакционную массу при перемешивании охлаждают, прибавляют 1 мл холодной воды и растирают в фарфоровой ступке. Неразложившийся роданид аммония извлекают экстракцией теплым этиловым спиртом. Остаток представляет собой тиомочевину. Для данной работы нет смысла очищать ее от примесей роданида аммония. Поэтому осадок отфильтровывают, сушат между листами фильтровальной бумаги и готовят 1%-й раствор.
Каталитическая активность ферментов
проявляется в условиях физиологической
температуры, близкой к температуре тела.
Большинство ферментов проявляет максимальную
каталитическую активность в границах +30 
+50 °С. Увеличение
температуры до +60 °С и выше приводит к тепловой
денатурации белков, поэтому они теряют свою
активность (инактивируются). При понижении
температуры каталитическое действие ферментов
вначале снижается, а затем прекращается. Однако
возвращение фермента в оптимальные
температурные условия восстанавливает его
активность.
Опыт 5. Влияние температуры на активность фермента уреазы
Цель работы. Изучить влияние температур на активность фермента уреазы.
Оборудование и реактивы. Фарфоровая ступка с пестиком, мерный цилиндр, пробирки (3 шт.), спиртовка, пробиркодержатель, стакан с охлаждающей смесью льда и поваренной соли; арбузные семечки (8–10 шт.), вода дистиллированная, мочевина (1%-й раствор), фенолфталеин (0,1%-й спиртовой раствор).
Методика проведения опыта
1) Разотрите в ступке очищенные от кожуры арбузные семечки с 15 мл воды до получения однородной суспензии.
2) Перелейте полученную суспензию в 3 пробирки.
3) Первую пробирку поставьте в стакан с охлаждающей смесью до полного замерзания суспензии. Когда суспензия замерзнет, прилейте к ней 5 мл раствора мочевины и прибавьте несколько капель фенолфталеина.
4) Во вторую пробирку добавьте 5 мл раствора мочевины и 2–3 капли раствора фенолфталеина. Оставьте ее в качестве контроля.
5) Суспензию в третьей пробирке нагрейте до кипения. После охлаждения до комнатной температуры (можно опустить пробирку в холодную воду) добавьте 5 мл раствора мочевины и несколько капель раствора фенолфталеина.
Результаты. Занесите результаты эксперимента в таблицу.
Таблица
| № пробирки | Объем суспензии арбузных семечек, мл | Объем раствора мочевины, мл | Изменения температуры |
Изменение цвета фенолфталеина |
| 1 | 5 | 5 | Охлаждение | |
| 2 | 5 | 5 | Комнатная температура | |
| 3 | 5 | 5 | Нагревание до кипения |
Выводы. Сформулируйте выводы. Используйте результаты опыта для записи выводов.
Многие вещества ингибируют действие фермента уреазы. Известно, что фенолы и их производные, спирты в высокой концентрации, формальдегид вызывают денатурацию белковой части фермента. Определенные изменения происходят в ферментах и под действием ионов. Отметим также, что в некоторых напитках, например в чае, содержится вещество эпигаллокатехин-3-галлат, которое ингибирует уреазу.
Опыт 6. Инактивация фермента уреазы
Цель работы. Определение ингибиторов фермента уреазы.
Оборудование и реактивы. Пробирки (3 шт.), водная суспензия арбузных семечек, мочевина (1%-й раствор), фенолфталеин (0,1%-й спиртовой раствор); испытуемые соединения: отвар зеленого чая, 0,01 M растворы фторида натрия, хлорида натрия, нитрата серебра, сульфата никеля, ацетата свинца, раствор пероксида водорода (1 объем 3%-го раствора разбавляют 10 объемами воды).
Методика проведения опыта
1) К суспензии арбузных семечек объемом 3 мл приливают равный объем раствора испытуемого соединения (предполагаемого ингибитора), тщательно перемешивают смесь; приливают 4 мл раствора мочевины и добавляют 1–2 капли раствора фенолфталеина.
2) Через 5 мин. наблюдают за изменением окраски раствора. Если произошло изменение окраски в той или иной пробирке, то считают, что данное вещество не является ингибитором фермента.
Результаты. Результаты опыта занесите в таблицу.
Выводы. Сформулируйте выводы.
Л и т е р а т у р а
Гусева К.Е., Проскурина И.К. Разработка химического эксперимента с экологическим содержанием. Химия в школе, 2002, № 10, с. 72–74; Кульберг Л.М. Синтезы органических реактивов для неорганического анализа. М.: ГОНТИ, 1947; Цыганов А.Р., Сучкова И.В., Ковалева И.В. Биохимия. Практикум: учебное пособие. Минск: ИВЦ Минфина, 2007; Шеховцева Т.Н. Ферменты: их использование в химическом анализе. Соросовский образовательный журнал, 2000, т. 6, № 1, с. 44–48.