Химический твердофазный
синтез рибонуклеазы

 

Ферменты являются необходимыми участниками биосинтеза белков, запрограммированного на генетическом уровне, и одновременно с этим белки служат регуляторами генетических функций. Фермент рибонуклеаза – органический катализатор, занимающий одно из центральных мест в метаболизме живой клетки.

Когда в 1953 г. химией белков занялся Роберт Брюс Меррифилд, он четко представлял стоящие перед исследователями задачи: «Белки – это ключевые компоненты всех живых организмов. Все ферменты, являющиеся катализаторами биологических реакций, и многие регулирующие их гормоны – белки. Если мы хотим понять и научиться контролировать то, что происходит в организме, мы должны прежде всего узнать состав, структуру и функции каждого отдельно взятого белка».

Начало этому было положено, когда С.Мур и У.Х.Стайн определили аминокислотный состав различных белков. Мы уже писали (см. Химия. 2007, № 10), что в 1954 г. они опубликовали данные об аминокислотном составе фермента рибонуклеазы. Работы американских ученых не только помогли в дальнейшем установлению третичной структуры этого фермента, изучению механизма его действия, но также явились необходимой предпосылкой полного химического синтеза рибонуклеазы.

Молекулы рибонуклеазы, как и другие белковые молекулы, представляют собой цепи аминокислот, связанные пептидными связями. Стремясь понять структуру этих больших и очень сложных органических молекул, ученые пытаются синтезировать их из химических компонентов – аминокислот. Причем соединяться мономеры должны в строго определенной последовательности. Схематически образование пептидной связи выглядит достаточно просто. Это конденсация двух аминокислот с отщеплением молекулы воды:

Образующийся дипептид реагирует далее со следующим мономером – аминокислотой, образуя тример, который, в свою очередь, взаимодействует с очередной аминокислотой и т.д.

Существуют два классических способа (метода) связывания аминокислот – ступенчатый и фрагментационный. Согласно ступенчатому методу, разработанному в начале XX в. Э.Фишером, аминокислоты по одной добавляются к растущей пептидной цепи. Фрагментационный метод предусматривает предварительное связывание аминокислот в короткие пептидные фрагменты, которые затем соединяются с образованием больших молекул пептидов. Однако, вне зависимости от выбранного метода, для того, чтобы получить полипептид заданного строения, необходимо строгое соблюдение целого ряда жестких требований. Очень четко они были изложены Л.М.Халимской, доцентом Новосибирского госуниверситета.

• Селективность соединения мономерных звеньев. Каждая из аминокислот имеет группы NH₂ и COOH. Предположим, что для получения нужной последовательности карбоксильная группа первой аминокислоты должна прореагировать с аминогруппой второй аминокислоты. А другие функциональные группы при этом не должны участвовать в реакции, поэтому их надо предварительно «защитить», т.е. блокировать при помощи специальных защитных групп.

• Активация функциональных групп. Для того чтобы смогла образоваться пептидная связь, открытую (незащищенную) группу приходится активировать, поскольку сами по себе группы NH₂ и COOH в аминокислотах между собой не реагируют. Обычно активируют карбоксильную группу.

• Выход на каждой из стадий должен составлять не менее 96–98 %. Иначе ничего не получится, общий выход конечного полипептида будет катастрофически падать с ростом длины полимерной цепочки. Несложный пример: для получения декапептида (10 звеньев) потребуется 9 реакций поликонденсации. Пусть выход на каждой стадии составляет 90 %. Это немало! Но суммарный-то выход будет

0,9⁹•100 = 39 %.

Для двадцатизвенного полипептида выход уже равен

0,9¹⁹•100 = 13,5 %.

А ведь задача состоит в том, чтобы синтезировать полипептидные цепи, насчитывающие сотни мономерных звеньев. Было установлено, что, например, интересующая нас рибонуклеаза состоит из 124 аминокислотных остатков (относительная молекулярная масса ее равна 13 683). Целевой продукт просто затеряется в намного превосходящей его массе примесей.

• Мягкие условия процесса. Это касается всех стадий – введения и удаления защитных групп, активации и, собственно, конденсации. Повышенные температуры, использование концентрированных растворов сильных кислот и щелочей обязательно приведут к разрушению как уже имеющихся, так и вновь образованных химических связей и поэтому недопустимы.

Выполнить все эти условия, используя традиционные методы синтеза, было практически невозможно. Последовательность защиты, активации, синтеза и удаления защищающей группы должна повторяться до тех пор, пока не образуется пептидная цепочка нужного состава. Побочные продукты реакции и реагенты (протекторы, депротекторы и активаторы), которые использовались на каждой стадии, нужно было вымывать, а полученный в результате пептид – очищать, прежде чем добавить следующую аминокислоту. Это делало процесс длительным, трудоемким и утомительным, а главное – неэффективным. Тем не менее, В.Дю Виньо в 1953 г., используя классические методы, смог синтезировать гормоны окситоцин и вазопрессин, молекулы которых состоят из девяти аминокислотных остатков. Первый полный синтез гормона окситоцина рассматривался как выдающееся достижение, принесшее его автору Нобелевскую премию 1955 г. Сам Меррифилд успешно получал пептиды, содержащие от 20 до 40 аминокислот, правда, в выбранной наудачу последовательности. Судя по всему, это был каторжный труд.

Мы точно не знаем, только ли стремление преодолеть синтетические трудности подвигло в 1962 г. Меррифилда (он в тот период работал в Рокфеллеровском институте медицинских исследований) на разработку твердофазного синтеза пептидов. Его оригинальная идея состояла в том, что молекулу аминокислоты, с которой начинается наращивание полипептидной цепочки, химически закрепляют на нерастворимом полимерном носителе (твердая фаза).

Наиболее эффективным носителем для первой аминокислоты оказался сополимер стирола и дивинилбензола. Такой носитель можно было поместить в колонку, через которую пропускают раствор второго мономера. Образовавшийся в результате конденсации дипептид оказывается также присоединенным к твердой фазе. При этом нежелательные побочные продукты и реагенты могут вымываться из реакционного сосуда. А вот растущий пептид остается незатронутым. Эту процедуру можно повторять многократно. Когда же процесс синтеза завершится, конечный пептид может быть отделен от своего носителя и очищен обычными методами.

Рассмотрим подробнее схему твердофазного синтеза (рис. 1).

Первая стадия процесса – закрепление концевой аминокислоты на поверхности полимерного носителя (обозначен черным кружком). При этом образуется так называемая «якорная» связь. Обратите внимание, что аминогруппа первого мономера уже защищена, в данном случае ацилированием. В 1932 г. M.Бергман и Л.Зервас использовали в синтезе пептидов бензилоксикарбонильную группу C₆H₅CH₂OC(O) (карбобензоксигруппу) для защиты -аминогрупп аминокислот. Другой пример N-защитной группы – трет-бутоксикарбонильная группа (СН₃)₃СОС(О). Защитные группы должны надежно закрывать амино- и карбоксильную группы в процессе синтеза и потом легко сниматься без разрушения пептидной связи.

Дальнейшие химические превращения происходят на поверхности твердой фазы, что позволяет заменить сложные и трудоемкие процедуры очистки промежуточных продуктов простыми операциями отмывки. Переходя к наращиванию пептидной цепи, прежде всего убирают группу, защищающую конечную NH₂-группу (вторая стадия).

Пропуская через колонку раствор другой аминокислоты с защищенной аминогруппой, создают пептидную связь между первой и второй аминокислотой. Это – третья стадия, для проведения которой или активируют карбоксильную группу, превращая ее в хлорангидрид, или проводят конденсацию в присутствии сильных водоотнимающих веществ (Меррифилд использовал дициклогексилкарбодиимид C₆H₁₁N=C=NC₆H₁₁, это может быть также этоксиацетилен).

После снятия N-защитной группы синтез пептида можно вести далее, повторяя активацию и добавление новой защищенной по аминогруппе аминокислоты. Каждый такой цикл занимал у Меррифилда несколько часов. Теперь на вооружении у химиков имеются более эффективные конденсирующие агенты – производные фосфония и урония. В результате время синтеза одной пептидной связи сокращается до 10–15 мин.

После наращивания пептидной цепи до нужной величины гидролизуют «якорную» сложноэфирную связь в более жестких условиях (четвертая стадия), при этом полипептид переходит в раствор. Выход целевого продукта почти количественный!

Нашлись и противники новой технологии. По их мнению, полученные с ее помощью пептидные продукты были недостаточно очищены от примесей. Меррифилд признавал, что эта проблема является неотъемлемой частью исследования пептидного синтеза. Но это не пугало ученого. «Усовершенствования в методах разделения появляются постоянно, – говорил он. – И то, что сегодня кажется недостижимым, завтра может оказаться на удивление простым».

Меррифилд привык все делать своими руками. К разработке более совершенного метода синтеза пептида он приступил, организовав мастерскую в подвале своего дома. Его научный руководитель профессор Д.У.Вулли поддерживал Меррифилда в научном плане, а верным помощником оказался Дж.Стюарт. Практически все делали сами, иногда приглашали техника Н.Джернберга из мастерской по изготовлению аппаратуры при Рокфеллеровском институте. На создание автоматического синтезатора ушло три года упорного труда.

Придуманное и успешно работающее устройство представляло собой контейнер для аминокислот и реагентов – реакционный сосуд с автоматическими впускным и выпускным клапанами и программным механизмом, который регулировал последовательность процесса (рис. 2).

С помощью сконструированного аппарата Меррифилд и его коллеги синтезировали несколько пептидных гормонов, включая брадикинин, окситоцин и ангиотензин (октапептид, регулирующий артериальное давление). На получение белка инсулина (содержит 51 аминокислоту в двух цепях) им потребовалось всего лишь 20 дней, в то время как раньше этот процесс занимал несколько месяцев.

Синтез рибонуклеазы включал 369 последовательных реакций. Тем не менее, этот фермент был синтезирован Меррифилдом в 1969 г. менее чем за месяц.

Высокопроизводительный твердофазный синтез пептидов в сочетании с разделяющими способностями разработанного метода очистки белков – препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии – обеспечили выход на качественно новый уровень химического синтеза пептидов. И это способствовало развитию различных областей биохимии, молекулярной биологии, генной инженерии, биотехнологии, фармакологии и медицины. По мнению многих авторитетных ученых открытие Меррифилда оказало большое влияние на сам образ мышления специалистов.

* * *

МЕРРИФИЛД Роберт Брюс (15.VII.1921, Форт-Уэрт, штат Техас (США) – 14.V.2006, Кресскилл, штат Нью-Джерси). Будущий биохимик был единственным сыном в семье Лоурэн Меррифилд и Джорджа Меррифилда. Отец Роберта был продавцом мебели, ему постоянно приходилось искать работу, переезжая с места на место. Через два года после рождения Роберта семья Меррифилдов оказалась в Калифорнии. Меррифилд позже подсчитал, что в период Великой депрессии 1930-х гг. он успел посетить почти 40 школ, прежде чем его семья осела, наконец, в Монтебелло (штат Калифорния). Именно здесь будущий ученый заинтересовался химией, но не только ею одной. Известно, например, что, занимаясь в школьном астрономическом клубе, он сконструировал небольшой телескоп.

В 1938 г. Меррифилд окончил среднюю школу. Сначала он поступил в Джуниор-колледж в Пасадене, но уже в следующем году перешел в Калифорнийский университет в Лос-Анджелесе, где химию начал изучать всерьез. Его заинтересовали исследования в лаборатории М.Данна – в это время там синтезировали дегидроксифенилаланин – аминокислоту, которая участвует в передаче нервных импульсов и применяется для лечения болезни Паркинсона.

Не прерывая учебы в университете, Меррифилд устроился туда. Работать было интересно, к тому же это позволило ему немного поправить свои финансовые дела. В 1943 г. Меррифилд получил степень бакалавра и целый год работал химиком в Научно-исследовательском фонде Ф.Р.Парка. Стипендия от «Анхейзер-Буш инкорпорейшн» дала ему возможность вернуться в университет и продолжить учебу: Меррифилд поступил в аспирантуру. Работая ассистентом-исследователем в медицинской школе Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе (1948–1949), он изучал дрожжевые пурины и пиримидины (циклические азотистые основания) под руководством профессора Д.У.Вулли, оказавшего сильное влияние на его становление как ученого. Исследуя способность этих соединений стимулировать рост бактерий, Меррифилд разработал целую систему биологического качественного анализа.

В 1949 г. Меррифилд, уже имея докторскую степень, был назначен ассистентом-биохимиком в Рокфеллеровский институт медицинских исследований (в настоящее время – Рокфеллеровский университет) в Нью-Йорке. С этим институтом связана вся его дальнейшая научная деятельность. Здесь в 1953 г. Меррифилд стал научным сотрудником, а через 5 лет – адъюнкт-профессором.
И, наконец, в 1966 г. он стал полным профессором, оставаясь в этом звании до конца своей научной карьеры.

Из целой армии биохимиков, предпринявших глобальное исследование белковых молекул в 1950-х гг., Меррифилд относится к тем, кто не только изучал их состав и структуру, но и непосредственно занялся синтезом белка. Еще в 1948 г. Меррифилд, женившись на Элизабет Ферлонг, работавшей в Рокфеллеровском университете над проблемой синтеза белка интерферона, ценного терапевтического средства для лечения вирусных заболеваний, осознал необходимость создания эффективных методов получения белковых молекул. Однако почти десять лет ушло на работы с использованием традиционных синтетических подходов, отнимающих так много времени и труда.

В 1959 г. ученый записал в своем исследовательском блокноте: «Необходим быстрый, количественный, автоматизированный метод синтеза длинных пептидных цепей». И работа закипела. Уже в 1962 г. он сообщил, что в относительно короткий период времени новый метод, названный твердофазным пептидным синтезом, обеспечил большой выход искусственных пептидов – почти 100 % предсказанного количества. Рутинная работа, включающая повторяющиеся однообразные стадии пропускания защищенных мономеров, активаторов, растворителей через колонку наводила на мысль об автоматизации процесса. Задача заключалась в конструировании аппарата, способного автоматизировать пептидный синтез. И уже в 1965 г. Меррифилд создал первую работающую модель автоматизированного устройства для твердофазного пептидного синтеза.

А в 1969 г. Меррифилд (вместе с Берндом Гуте) завершил первый успешный синтез рибонуклеазы. В 1984 г. ученому была вручена Нобелевская премия по химии за предложенную им методологию химического синтеза на твердых матрицах. «Совершенно новый подход к органическому синтезу создал новые возможности в области пептидно-белковой химии и химии нуклеиновых кислот, – отметил Б.Линдберг во вступительной речи от имени Шведской королевской академии наук. – Он в значительной мере стимулирует развитие биохимии, молекулярной биологии, медицины и фармакологии, а также имеет большое практическое значение для разработки новых лекарственных препаратов и для генной инженерии».

В 1968 г. Меррифилд был приглашенным профессором в Упсальском университете в Швеции. С 1969 г. он – заместитель главного редактора «Международного журнала по исследованию пептидов и протеинов (International Journal of Peptide and Protein Research).

В 1992 г. Р.Меррифилд вышел в отставку, хотя еще почти пять лет после этого продолжал работать в лаборатории.

Супруги Меррифилды долгое время прожили в Кресскилле (штат Нью-Джерси), здесь же главу семьи в 2006 г. проводили в последний путь супруга Элизабет и все многочисленное семейство: сын, пять дочерей и 16 внуков.

Заслуги Меррифилда были высоко оценены научным сообществом. В число наград, которых удостоен ученый, входят международная награда Гарднеровского фонда (1970), награда за творческую работу в области синтеза органических соединений (1972) и медаль Николса (1973) от Американского химического общества. Меррифилд – член американской Национальной академии наук. Ему присвоены почетные степени университета Колорадо, а также Йельского и Упсальского университетов.

Л и т е р а т у р а

Халимская Л.М. Химический синтез белков и нуклеиновых кислот с использованием автоматических синтезаторов. Соросовский образовательный журнал, 2000, т. 6, № 10, с. 37; Лауреаты Нобелевской премии: Энциклопедия. Пер. с англ. М.: Прогресс, 1992; Гринштейн Дж., Виниц M. Химия аминокислот и пептидов. Пер. с англ. M.: Мир, 1965; Шредер Э., Любке К. Пептиды. Пер. с англ. Т. 1, 2. M.: Мир, 1967; Дэвени Т., Гергей Я. Аминокислоты, пептиды и белки. Пер. с англ. M.: Мир, 1976; Гросс Э., Маненхофер И., Джоунс Дж. Пептиды. Основные методы образования пептидных связей. Пер. с англ. M.: Мир, 1983; Ленинджер А. Основы биохимии. Пер. с англ. Т. 1–3. M.: Мир, 1985; Якубке X.-Д., Ешкайт X. Аминокислоты, пептиды, белки. Пер. с нем. M.: Мир, 1985; Polymer-supported reactions in organic synthesis. Еd. by P.Hodge, D.C.Sherrington. Chichester, 1980.

А.Б.ЗАЧЕРНЮК