Сделать животных светящимися

Нобелевская премия 2008 г. по химии

Все науки настолько связаны между собою,
что легче изучать их все сразу,
нежели какую-либо одну из них
в отдельности от всех прочих.
Рене Декарт

В наше время границы между многими науками становятся все более размытыми, часто трудно бывает указать, где кончается биология и начинается физика или химия. Лауреатами Нобелевской премии 2008 г. по химии стали американские ученые-биохимики Осаму Симомура (Osamu Shimomura), Мартин Чалфи (Martin Chalfie) и Роджер Тсиен (Roger Tsien). Они удостоены этой самой престижной научной награды за получение и разработку различных форм зеленого флуоресцентного белка (Green Fluorescent Protein). В научной литературе этот белок принято сокращенно обозначать GFP.

Премированная работа представляет собой пример переплетения научных интересов разных ученых и их судеб, порой весьма драматичных. Работа имеет не только большое научное значение, она очень эффектна и привлекательна внешне.

Трое премированных авторов никогда не работали вместе, но обстоятельства сложились таким образом, что их раздельные усилия привели к важному общему результату.

Таинственный светящийся мир

Способность некоторых веществ испускать свой собственный свет называют люминесценцией. Многие, вероятно, видели в темноте свечение древесных гнилушек, светлячков или морского прибоя. Когда люминесценцию производят вещества в живых организмах, то это называют биолюминесценцией. Наука никогда не ограничивалась только простыми наблюдениями, следующий необходимый шаг – описание наблюдаемого явления. Именно это проделал в 1761 г. датский зоолог Петер Форскол. Во время экспедиции на корабле по Северному морю он заметил в воде странное свечение, оказалось, что светятся небольшие (диаметром 2–3 см) медузы.

Форскол выловил несколько таких медуз и поместил их в ведро, а затем приступил к наблюдениям. Оказалось, что, если их слегка потревожить, они начинают светиться ярким зеленым светом. Медузы получили название «экворея» (Aquorea от лат. aqua – вода), с этого начался долгий путь исследования процессов биолюминесценции.

Среди наземных обитателей светящихся организмов немного: колонии некоторых бактерий, отдельные виды грибов и насекомых; их свечение, как правило, непрерывное. Кстати, свечение древесных гнилушек вызвано грибницей опенка и происходит в результате химических процессов при окислении.

Громадное количество светящихся существ (более тысячи видов) среди обитателей морских глубин. Свечение моря волновало людей с незапамятных времен, вызывая не только изумление и восхищение, но и суеверный страх. Отсутствие научных знаний невольно приводило к фантастическим объяснениям, отразившимся в мифах, легендах и сказках.

Во многих случаях свечение морских обитателей импульсное, они испускают короткие световые вспышки длительностью 0,1–1 с. Эти вспышки необходимы для отпугивания хищников или быстро движущихся животных, которые при случайном столкновении могут механически повредить нежный светящийся организм, такой, как у медузы. У некоторых глубоководных рыб надо ртом имеется подвижный отросток – «удилище», а на нем – световая приманка для жертвы. Другие рыбы используют вспышки для освещения окружающего пространства.

Удачный объект – половина успеха

Вначале отметим, что существуют принципиально различные процессы, позволяющие светиться живым организмам. Первый – представляет собой набор биохимических реакций с участием специальных ферментов (биокатализаторов). Такое свечение использует энергию химической реакции и может продолжаться, пока не будут исчерпаны необходимые реагенты.

Существует также иной способ: вещество поглощает из внешнего источника (например, дневное освещение) ультрафиолетовую часть спектра, которая обладает высокой энергией. В результате молекула переходит в так называемое возбужденное состояние, но она может пребывать в нем очень недолго. Чтобы вернуться к «нормальному» состоянию, ей необходимо избавиться от излишка энергии, которую она получила с ультрафиолетовым облучением, что достигается излучением света. Это и есть флуоресцентный свет. Поскольку часть энергии ушла на перевод молекулы в возбужденное состояние, испускаемый свет имеет бо?льшую длину волны – сдвигается в сторону красной части спектра, что соответствует более низкой энергии. Это общее правило флуоресценции – всегда испускается свет с бо?льшей длиной волны, нежели поглощенный.

Итак, при флуоресценции не требуются какие-либо реакции с участием ферментов, нужна лишь ультрафиолетовая подсветка. Именно таким свойством, как оказалось, обладает зеленый флуоресцентный белок GFP, присутствующий в медузе экворея, той самой, которую впервые описал Форскол. Этот белок при облучении ультрафиолетовым или синим светом дает голубовато-зеленое свечение.

Осаму Симомура – первый из упомянутых нами лауреатов – начал свои исследования с того, что сумел выделить (в 1956 г.) из морского моллюска экстракт фермента люциферазы (люциферин), обеспечивающий свечение за счет биохимических реакций. Накопленный экспериментальный опыт в сочетании с творческой фантазией позволил Симомуре сосредоточить внимание на новом объекте, который испускал свечение без участия люциферина. Это был GFP, выделенный ученым в 1962 г. из организмов медуз.

Структура GFP была расшифрована гораздо позже (в 1996 г.) в лаборатории Ремингтона. Молекула имеет форму, близкую к цилиндру, образованному лентами полипептидных цепей (рис. 1). Внутри цилиндра расположена хромофорная (в переводе с греческого – несущая свет) группа (показана в виде шаровой конструкции), которая химически связана с основной белковой молекулой.

На первый взгляд кажется, что строение хромофорной группы достаточно сложное, и то, как она получается, непонятно. На самом деле ее образование – результат трех весьма простых последовательных стадий, в результате каждой из которых выделяется вода в качестве побочного продукта. Все происходит внутри пептидного цилиндра, показанного на рис. 1. Биохимики давно знают, что все белковые молекулы собираются внутри живого организма из известных аминокислот – органических молекул, содержащих аминогруппу NH₂ и кислотную карбоксильную группу СООН. Эти аминокислоты имеют отличительный признак: между аминогруппой и карбоксильной группой находится всего один атом углерода, таким образом, общий вид всех природных аминокислот NH₂–CR₂–COOH. Органические заместители R у центрального атома углерода могут быть различными, в том числе и атомами водорода. При образовании белковых молекул концевая аминогруппа одной молекулы взаимодействует с концевой карбоксильной группой соседней молекулы с выделением воды:

NH₂–CR₂–COOH + NH₂–CR'₂–COOH —>NH₂–CR₂–CO–NH–CR'₂–COOH + H₂O.

Именно таким образом наращивается цепочка белковой молекулы.

Хромофорная группа в GFP собирается из трех аминокислот: тирозина, глицина и серина (рис. 2), которые присутствуют в каждом живом организме. Три молекулы объединяются в единый реагирующий центр. Две аминокислоты из трех (глицин и серин) прикреплены (подвешены) к внутренней полости основного цилиндра (на рис. 2 это показано с помощью волнистых линий). Далее все происходит следующим образом: гидроксильная группа тирозина реагирует с аминогруппой глицина, а аминогруппа тирозина взаимодействует с гидроксильной группой серина (реагирующие группы обведены штриховыми прямоугольниками), при этом выделяются две молекулы воды. Далее реагируют две аминогруппы и карбонильный кислород (обведены г-образным штриховым контуром), образуется пятичленный цикл с двумя атомами азота и двойной связью (так называемый имидазольный цикл), вновь выделяется молекула воды. На последней стадии молекула кислорода отрывает по одному атому водорода от двух атомов углерода (показаны на рис. 2 в виде утолщенных точек); выделяется молекула воды, и в итоге образуется хромофорная группа.

Несмотря на то, что строение этой группы можно назвать достаточно сложным, реакции, ведущие к ее образованию, весьма просты, а исходные реагенты – хорошо известные природные аминокислоты.

Полипептидный цилиндр (см. рис. 1) не только служит «реакционной колбой» для получения хромофорной группы, он также защищает ее от случайных химических воздействий.

Продолжение научной эстафеты

Все три Нобелевских лауреата в своих докладах с глубоким уважением упомянули имя ученого, без которого вся премированная работа могла не состояться, тем не менее, он не стал Нобелевским лауреатом. Первым, кто осознал возможности GFP, был американский биохимик Дуглас Прашер (Douglas Prasher). Ему пришла в голову интересная идея: выделить ген – участок ДНК, который обеспечивает в медузах синтез GFP, а затем ввести этот ген в другие организмы. В результате такой организм начнет синтезировать белки с флуоресцирующим хвостом (некий своеобразный фонарик). Облучая объект ультрафиолетовым светом, можно будет заметить, где синтезируется и в какие участки клетки направляется белок с «зеленым фонариком» на конце. Идея оказалась замечательной, и со временем ее удалось реализовать. Сложность состояла в том, что нужно было выделить не сам флуоресцирующий белок (это уже проделал ранее Симомура), а тот ген – участок ДНК, который в организме медузы экворея отвечает за синтез GFP.

В 1992 г. Прашеру удалось выделить нужный ген и определить в нем последовательность групп, которые кодируют синтез зеленого белка. К сожалению, на продолжение исследований ему не удалось получить денег (такое часто бывает в науке). Финансирование работ было прекращено, и работа приостановлена. Эстафету принял другой американец, один из лауреатов обсуждаемой нами Нобелевской премии – Мартин Чалфи. Узнав о работах Прашера на одной из конференций, он связался с автором работы и получил от него необходимую информацию вместе с образцами.

Чалфи проводил исследования, используя в качестве модельных организмов специальных круглых полупрозрачных червячков (Caenorhabditis elegans). Они имеют около 1 мм в длину, их движения (судя по имеющимся видеороликам и в полном согласии с латинским названием) достаточно элегантны. Эти червячки, состоящие точно из 959 клеток, очень подробно изучены биологами и считаются очень удобными объектами для экспериментов. Чалфи решил ввести в структуру ДНК изучаемых червей ген, кодирующий в медузах синтез GFP, что ему и удалось сделать. Полученный результат произвел на исследователей очень сильное впечатление: снимок червячка со светящимися участками тела был помещен на обложке одного из самых авторитетных научных журналов – «Сайенс» (Science) (рис. 3).

После этого во многих странах количество исследовательских работ с флуоресцирующим белком стало стремительно расти. Ген, вводящий в живой организм светящуюся метку, стали называть «репортерным». Он позволил проводить тонкие исследования с различными генетически модифицированными организмами, причем объект не требовалось препарировать или каким-либо образом разрушать, стало возможным наблюдать многие скрытые процессы визуально. Впервые ученые смогли под микроскопом следить в реальном масштабе времени, например, за ростом и характером связей в нейронах, за распространением раковых клеток в организмах лабораторных животных и т.д.

Все цвета радуги

Многие исследователи отмечали, что при воздействии ультрафиолетового света флуоресцентные белки постепенно «портятся» и флуоресценция гаснет. Третий лауреат премии Роджер Тсиен (американец китайского происхождения) описал схему синтеза хромофорной группы (см. рис. 2) и затем нашел способы направленно изменять ее структуру для того, чтобы сделать более стабильной, а флуоресценцию – более яркой. Фактически это была необычайно тонкая работа химика-синтетика. Более того, он разработал способы получения хромофорных групп, которые флуоресцируют разными цветами (рис. 4). Благодаря этому можно одновременно следить за несколькими процессами, происходящими в живых клетках, например различать раковые и нормальные клетки. В настоящее время практически в любой лаборатории, где ведутся исследования в области молекулярной биологии или биологии клетки, используют эти белки.

 

Рекламная яркость научной работы

Далеко не каждая серьезная научная работа имеет впечатляющее красочное продолжение, причем в той области, которая понятна почти каждому человеку, в том числе и далекому от науки. Имея широкий набор цветных белков, ученые стали вводить флуоресцирующий ген в организмы разных животных, в результате отдельные участки тела (или даже весь организм) становились светящимися. Научные журналы запестрели цветными снимками флуоресцирующих мушек-дрозофил, кроликов, обычных и летучих мышей (рис. 5).

Особенно сильное впечатление произвело сообщение группы тайваньских биохимиков, которые под руководством профессора Шинь-Джи (Shinn-Chih) в 2006 г. создали флуоресцирующих поросят. Для этого потребовалось с помощью необычайно тонкой экспериментальной техники ввести соответствующие гены в эмбрионы свиней. Полученные таким образом поросята имели отчетливый зеленоватый цвет кожи и глаз при дневном свете, более того, у них даже внутренние органы были зеленого цвета. В других опытах они имели ярко окрашенные оранжевые пятачки (рис. 6).

Подобные научные достижения настолько впечатляющи, что привлекают внимание не только ученых, но и широкой публики. Однако все это было проделано не для внешнего эффекта. Опыты с различными биологическими тканями свиней наиболее точно моделируют соответствующие процессы в тканях человеческого организма. Основная цель выведения таких свиней – визуальное наблюдение за развитием тканей при пересадке стволовых клеток.

Кратко поясним, что ставшие в последнее время популярными стволовые клетки после введения в организм находят поврежденную зону, далее они изменяются в зависимости от того, где находятся, т.е. приобретают нужную «специализацию» и начинают развиваться как обычная клетка. Иными словами, они могут наращивать поврежденный орган. С помощью цветных индикаторов можно будет также определять, получил ли организм генетическую вставку, введенную методами генной инженерии, или следить за развитием здоровых и больных клеток при онкологических заболеваниях.

Не только восторги

Факт присуждения Нобелевской премии всегда сопровождается восторженными отзывами научной общественности в газетах, журналах, на телевидении и на радио. В большинстве случаев это вполне оправданно, однако ничто не мешает нам взглянуть на эту ситуацию более спокойно. Фактически найден изящный аналитический метод, позволяющий следить буквально своими глазами за теми процессами, которые происходят в живых организмах, при этом какое-либо внутреннее механическое вмешательство не требуется и жизненные процессы никак не нарушаются. Можно ли все это рассматривать как выдающиеся фундаментальные работы? Академик Евгений Свердлов (заведующий лабораторией структуры и функции генов человека Института биоорганической химии РАН) считает, что открытие зеленого флуоресцентного белка и его использование сыграло очень большую роль в биологии, хотя, по мнению академика, до нобелевского масштаба это не дотягивает и революционных изменений в биологические исследования не вносит. Академик поясняет, что до появления зеленого флуоресцирующего белка использовались другие светящиеся метки – например, так называемая люцифераза. Это тот самый фермент, с которым начинал работать Симомура – первый из нынешних лауреатов. В этом случае для свечения используется энергия химической реакции.

Существует еще одна грустная нота, она часто возникает при обсуждении того, сколь справедливо выбраны лауреаты. Помимо упомянутых в этой статье биохимиков крупный вклад в создание и развитие флуоресцентных белков внес российский ученый, член-корреспондент РАН, заведующий лабораторией молекулярных технологий для биологии и медицины Института биоорганической химии РАН Сергей Лукьянов. Вместе со своими коллегами он создал целый ряд исключительно стабильных белков, которые флуоресцируют различными цветами. Одними из первых они смогли получить красный светящийся белок, выделенный из коралловых полипов.

Подобные обсуждения часто возникают после того, как становятся известны имена лауреатов. К сожалению, конкретную Нобелевскую премию нельзя присудить более чем трем ученым одновременно (таково непреложное правило), поэтому всегда кто-то может оказаться обделенным, как, например, упомянутый ранее Дуглас Прашер. В частных беседах члены нобелевского комитета иногда поясняют, что решение комитета не может удовлетворить всех, но если есть мнение, что представитель какой-либо страны несправедливо обойден, то ничто не мешает этой стране присудить своему ученому самые престижные национальные премии и воздать заслуженные почести. К сожалению, такое происходит не часто.

Коротко о самих лауреатах

Осаму СИМОМУРА родился в 1928 году в г. Киото. Он вырос в Маньчжурии, где служил в японской армии его отец. В 1945 г. Симомура, живший тогда в Нагасаки, был свидетелем взрыва сброшенной на город атомной бомбы, в результате чего он на некоторое время потерял зрение. Второй слайд его нобелевской лекции с изображением руин медицинского колледжа в г. Нагасаки после бомбардировки 1945 г. был далек от торжественности происходящего (рис. 7). В 1951 г. он окончил Университет Нагасаки, а с 1955 г. работал в Нагойском университете, где начал исследования флуоресценции морских животных.

В 1960 г. Симомура получил в Нагойском университете докторскую степень, затем переехал работать в США. Согласитесь, что это несколько необычный поворот судьбы: человек, пострадавший от американской атомной бомбардировки Японии, переезжает в США. Впрочем, за 15 лет многое изменилось, и он выбрал лучшее место для работы.

Вначале он работал в Принстоне (где и открыл зеленый флуоресцентный белок, вызывающий свечение у медуз), а с 1982 г. – в Лаборатории морской биологии.

С 2001 г. Симомура на пенсии. Он живет на полуострове Кейп-Код в штате Массачусетс, недалеко от своего последнего места работы.

Симомура был очень удивлен, когда узнал о решении Нобелевского комитета, при этом он добавил, что не считает себя химиком и мог скорее предположить, что получит премию в номинации «Физиология и медицина». Последний слайд его нобелевской лекции представлял собой снимок колонии медуз экворея, на фоне которых помещены слова благодарности всем коллегам, принимавшим участие в работе, а благодарность самой медузе подразумевалась.

* * *

Мартин ЧАЛФИ родился в 1947 г. Учился в Гарварде, где в 1977 г. получил докторскую степень за исследования в области нейробиологии. С 1982 г. и по сей день Чалфи – профессор в Колумбийском университете в Нью-Йорке. В 1984 г. он некоторое время работал в Лаборатории молекулярной биологии в Кембридже (Великобритания), где изучал нервную систему круглого червя Caenorhabditis elegans вместе с одним из классиков молекулярной генетики – Сидни Бреннером (благодаря трудам последнего этот червь и стал одним из важнейших модельных объектов современной биологии).

Во время нобелевского доклада Чалфи показывал портреты своих ближайших коллег, чередуя их со снимками этого червячка в различных ракурсах и на разных стадиях исследования (рис. 8).

 

 

Этот «знаменитый» светящийся червячок воистину стал для самого Чалфи символом победы и главным героем его доклада, пожалуй, таким же, как медуза экворея для Осаму Симомуры.

* * *

Роджер ТСИЕН родился в Нью-Йорке в 1952 г., в семье эмигранта из Китая, потомка царствующего дома небольшого дальневосточного государства (на территории которого, в частности, находился город Шанхай), вошедшего в конце X в. в состав Китая. Среди его родственников много выдающихся интеллектуалов — ученых, инженеров и преподавателей. Детство Роджера Тсиена прошло в Ливингстоне (штат Нью-Джерси). Затем он учился в Гарварде и в Кембридже (Великобритания), где в 1977 г. получил докторскую степень. До 1981 г. он работал в Кембриджском университете, а в 1982–1989 гг. – в Калифорнийском университете в Беркли. С 1989 г. Тсиен – профессор в Калифорнийском университете в Сан-Диего.

Во время нобелевской лекции он показал снимок пятнадцати (!) образцов флуоресцирующих белков, имеющих диапазон цветов от ярко-голубого до темно-малинового. Работа с таким многообразием цветных объектов придала поэтический настрой его творчеству. В одном из интервью он сказал, что очень любит многоцветие и рад тому, что это сочетается с его работой. На завершающем слайде его лекции рядом с именами коллег, участвовавших в работе, была помещена красочная флуоресцирующая картина «Закат, вид из окна калифорнийской лаборатории», созданная из разноцветных колоний бактерий, светящихся восемью различными цветами (рис. 9). В своей речи на нобелевском банкете он, выступая от имени трех лауреатов, сказал, что вся премированная работа – результат деятельности большого сообщества биохимиков, а лауреаты – просто три человека, которым повезло быть избранными Нобелевским комитетом.

Основной своей целью в будущем он считает разработку способов лечения онкологических заболеваний.

Послесловие

Для того чтобы особо отметить роль зеленого белка в развитии науки, на территории университета, в котором Симомура в 1962 г. впервые выделил GFP, установлена скульптура из нержавеющей стали высотой 1,7 м (рис. 10), изображающая структуру этого белка. Строго говоря, медуза экворея тоже вполне заслуживает памятника.

В заключение обратимся к пророческому эпиграфу, помещенному в начале статьи: возможно, мы приближаемся к единой науке, которая будет объяснять явления природы, не разделяя их на классы.

Материал подготовил М.М.ЛЕВИЦКИЙ