| НОВОСТИ НАУКИ |
Дешево и быстро
Российские ученые под руководством К.Г.Скрябина – академика в третьем поколении – сообщили в конце 2009 г. о “полногеномном секвенировании”, т.е. о прочтении всего генома человека – первого русского, отобранного из 1382 кандидатов, представителей 32 групп (в составе которых были 285 этнических русских). Уникально то, что столь грандиозная работа была осуществлена за каких-то два месяца. Напомним, что на первое прочтение генома человека ушло более десяти лет работы и три миллиарда долларов! Работа российских молекулярных биологов и других специалистов была осуществлена в рамках амбициозного международного проекта “Тысяча геномов”, в ходе которого прочитаны геномы Дж.Уотсона, сооткрывателя двуцепочной спирали ДНК, и К.Вентера, предложившего метод ускорения считывания последовательностей ДНК путем фрагментирования ее цепей с получением коротких “дробин” (shot-gun), а также китайца и корейца, нигерийца из племени йоруба и одной американки – жертвы рака. (Кстати, наши ученые взяли ДНК из лейкоцитов пациента, лечившегося в Онкоцентре РАМН им. Н.Н.Блохина.)
На обложке журнала “Сайенс” (Sсience), вышедшего 20 ноября 2009 г., редакция поместила фото початка кукурузы, без которой невозможно представить себе многочисленные доколумбовые цивилизации американского континента. Фото появилось неспроста, поскольку журнал поместил статью, описывающую расшифровку генома кукурузы. Геномов сейчас прочитано много, поэтому далеко не все оказываются представленными на страницах ведущих научных журналов мира. А ведь каких-то шесть лет назад мир восторгался сообщениями о том, что завершилось прочтение генома человека. Тогда на фоне громогласного звона литавр никто и представить себе не мог, что развитие геномики и биогенетической информатики пойдет семимильными шагами. Ведь расшифровка генома человека шла в течение долгих лет и стоила по нынешним меркам очень дорого.
В основу процесса прочтения был положен метод Фредерика Сенгера (F.Sanger), знаменитого британского ученого из Кембриджского университета, получившего свою первую Нобелевскую премию за расшифровку аминокислотного состава инсулина. (Попытки синтеза этого важного белкового гормона, снижающего уровень сахара в крови, окончились, к сожалению, неудачей. Химия – не биология, и многих вещей при синтезе биомолекул учесть пока не может.) Вторую Нобелевскую Сенгеру присудили за создание аналогов нуклеотидов, останавливающих синтез цепи ДНК, осуществляемый ферментом ДНК-полимеразой (нуклеиновые кислоты представляют собой цепочки, построенные из нуклеотидов).
Аналоги нуклеотидов потом, уже в эпоху СПИДа, совершенно неожиданно нашли себе применение в виде лекарств (азидотимидина), останавливающих синтез ДНКовой копии вирусной РНК. Эти лекарства первой волны, несмотря на свою токсичность, позволили врачам приостановить нарастание волны эпидемии СПИДа в развитых странах.
Надо признать, что в начале 1980-х гг., когда Сенгер разрабатывал свой метод, особенно торопиться было некуда, поскольку никто и вообразить себе не мог, что в этой земной инкарнации доведется лицом к лицу столкнуться с такой грандиозной задачей как чтение генома, тем более генома человека. Ученые уже тогда отмечали главное преимущество метода Сенгера, позволяющего использовать ДНК-полимеразы, чрезвычайно устойчивые к ошибкам при считывании информации. Но повторим, что в те времена было некуда торопиться, поэтому никто и не думал “задействовать” другие явные преимущества этого фермента, а именно высокую скорость процесса, которую он обеспечивал.
Оно и неудивительно, поскольку делалось все вручную, метод был трудоемкий, однако полученные с его помощью результаты не требовали молекулярных “корректоров”. И громом среди ясного неба явился метод К.Вентера (Сraig Venter), предложившего использовать цепи ДНК, фрагментированные на мелкие кусочки – ДНК-“дробины” (shotguns, pellets). Большинство ученых полагало, что дальнейшее развитие геномики пойдет по довольно спорному пути сопоставления этих двух подходов.
Однако развитие науки геномики пошло “иным путем”. Никто не мог предвидеть появления достаточно стойких флуоресцентных красителей разного цвета, с помощью которых можно метить все четыре вида нуклеотидов, входящих в состав ДНК. Непредсказуемо было и бурное развитие нанотехнологии, обеспечившей ученых-геномщиков “пробирками”, имеющими диаметр 70 и глубину 100 нм. Появились также новые усовершенствованные микроскопы, “совместимые” с компьютерами, что дало возможность считывать нуклеотидные последовательности в реальном времени.
Cинтез нуклеиновых кислот осуществляется с использованием в качестве исходных веществ энергоемких трифосфатов, например аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ). Фермент полимераза, синтезируя ДНК, отщепляет от трифосфата два фрагмента перед включением нуклеотида в ее цепь. “Сладкая парочка” фосфатов имеет огненно-рыжий цвет, поэтому отщепленные фосфаты называют еще пирофосфатом (от греч. рy'r – огонь, факел, светильник). Пирофосфат не пропадает втуне, поскольку используется для синтеза трифосфата, например все той же АТФ, которая необходима для работы люциферазы*. Понятно, что наиболее распространенный на сегодня метод быстрого считывания последовательностей нуклеотидов ДНК получил название пирофосфатного.
Суть метода довольно проста и начинается с синтеза цепочек ДНК длиной около сотни нуклеотидов, или “букв” ген-кода, которые прикрепляют к поверхности довольно крупных гранул (микросфер). Последние оказываются в микроскопических лунках-“колодцах” (wells) объемом 1 пл (пиколитр – одна триллионная литра), заполненных мелкими полистирольными наносферами-“дробинками” с молекулами фермента люциферазы. ДНК-полимераза отщепляет пирофосфат, необходимый для синтеза АТФ, которая дает энергию для окисления люциферина с испусканием фотонов. По цвету его свечения можно судить, какой из четырех нуклеотидов ДНК-полимераза включила в качестве звена в синтезируемую цепь, недаром метод получил официальное название “четырехцветный имиджинг” (four-colour imaging). Так оказывается прочтенной буква текста, зашифрованного в молекуле ДНК, и система начинает следующий цикл считывания.
Указанный метод наглядно иллюстрируется рисунком, взятым из рекламного проспекта компании Аррlied Biosystems (by Michael Metzker) и опубликованного в журнале Nature Review Genetics в 2009 г.
1) Стрелка cверху показывает ток динуклеотидтрифосфатов над “платформой”, или пиколитр-титровальной платой (flow single dNTP across РТР) – платой титрования с лунками объемом 1 пл;
2) С – цитозин, один из четырех нуклеотидов, “букв” ген-кода;
3) внизу показано содержимое одной из лунок, в которой находится микросфера с закрепленными на ней фрагментами цепи ДНК; один из фрагментов показан в виде цепочки с молекулой фермента полимеразы (polymerase) на ее конце;
 |
Рис. Иллюстрация пирофосфатного
|
4) пирофосфат (РРi), образовавшийся после действия полимеразы, идет на синтез АТФ (АТР) из нерасщепляемого аналога АТФ с серой (АРS), которая “изымается” ферментом сульфурилазой (sulphurylase), молекулы которого вместе с люциферазой (luciferase) укреплены на наносфере;
5) энзим люцифераза с помощью АТФ окисляет люциферин (luciferin) до оксилюциферина, в результате чего генерируются фотоны флюоресцентного свечения (light), сигнализирующие о включении цитозина в цепь.
Так постепенно шаг за шагом считывается последовательность нуклеотидов в фрагменте цепочки ДНК.
Сегодня существует более десятка самых разных методов быстрого чтения геномов с помощью новейших машин. Они получили общее название “следующее поколение” [next-gen(eration)], но их описание довольно сложно и скучно. Эти методы позволяют одновременно оперировать миллионами и миллиардами коротеньких цепочек ДНК, что позволяет проводить параллельное чтение на пяти и более машинах сразу.
Одним из недавних прорывов явилась публикация в ноябре 2008 г. генома женщины, страдающей острой миелоидной лейкемией, ДНК которой ученые расшифровывали параллельно с геномом здорового человека.
Заметим, что отечественные ученые, использовавшие оба метода, один из которых – пирофосфатный, оперировали 48 и 60 миллиардами фрагментов. Более того, в рамках осуществления проекта “Тысяча геномов” были прочитаны геномы еще 50 человек. Можно напомнить, что “Тысяча геномов” входит составной частью в еще более масштабный проект “10 000 геномов” по расшифровке геномов не только людей, но также многих животных и растений, в том числе и полезных.
Один из методов нового поколения, обходящийся без пирофосфата, позволяет “читать” одиночные цепи ДНК в реальном времени, используя всего одну молекулу ДНК-полимеразы. Молекулярный комплекс ДНК-фермент помещают в тончайшей алюминиевой фольге на дно еще более миниатюрного колодца, объем которого составляет одну миллиардную от заполненного многочисленными “дробинками” с люциферазой, о котором говорилось выше. Ничтожность объема становится понятной, если учесть, что поперечник двуцепочной молекулы ДНК составляет всего 2,3 нм. Лазерный луч вызывает возбуждение красителя и “ответное” свечение, или флуоресценцию, одного из четырех цветов, сигнализируя тем самым о включении в цепь того или иного нуклеотида.
Для повышения точности считывания, достигающей 99,3 %, машина на самом деле прочитывает геном в общей сложности 15 раз, сравнивая и подобно корректору перепроверяя полученные генетические тексты с “классическим” (каноническим) геномом человека, прочитанным несколько лет назад вручную.
Необходимость использования сложных машин для расшифровки геномов в конце первого десятилетия геномного миллениума объясняет, делает понятным привлечение в эту область инженеров. Один из них, являющийся сотрудником Станфордского университета, с помощью еще двух человек прочитал собственный геном всего за месяц. Это было сделано с помощью машины, стоящей сейчас миллион долларов, и реактивов (для прочтения), обошедшихся в 20 тысяч! Столь дешево и быстро не читался до того момента еще ни один геном. По крайней мере сейчас прочтение генома обходится в четверть миллиона. Почему же такая разница?
Дело в том, что в Станфорде геном был прочитан с большими ошибками. Количество “опечаток” по сравнению с классическим геномом человека составило одну на 20 тысяч нуклеотидов, что недопустимо много. Оценки, сделанные экспертами, показывают, что подлинный прорыв не только в геномике человека, но, что самое главное, в ее применимости в медицине, наступит тогда, когда количество ошибок снизится в пять раз, а стоимость прочтения – до пяти тысяч долларов.
Сейчас пока трудно сказать, когда это может произойти, но прогресс последних пяти лет показывает, что поставленная цель близка.
Реальность ожиданий подтверждается сообщением, опубликованным в первом номере журнала “Сайенс”, увидевшем свет 1 января 2010 г. В нем была помещена статья гарвардских ученых, среди них и наш соотечественник – Игорь Назаренко, прочитавших в сотрудничестве со своими коллегами из одной из калифорнийских биотехнологических компаний сразу три генома людей, используя совершенно новый метод самосборки наноструктур (nanoarrays) ДНК. Новая “платформа”, созданная специалистами-биотехнологами, – это самая настоящая “игра в бисер”, представленный наносферами, наношариками (nanoballs) ДНК, возникающими при ее самосборке.
Химия ферментов позволяет проводить независимый анализ нуклеотидов, или “букв” ген-кода с требуемой точностью, не превышающей одной ошибки на сто тысяч звеньев цепочки ДНК! Столь высокая точность достигнута благодаря 45–87-кратному “покрытию” каждого из геномов, в которых были определены от трех до четырех с половиной вариантов считывания последовательности (sequence).
Немаловажно подчеркнуть, что впервые стоимость прочтения генома такой высокой точности не превысила четыре с половиной тысячи долларов, что как минимум в четыре раза ниже стоимости самого дешевого и весьма неточного метода прочтения, о котором говорилось выше. Тем самым ученые еще на шаг приблизились к желанной цели, сформулированной весьма просто как “геном за тысячу”.
Всего лишь за первое десятилетие “геномного миллениума” стоимость чтения генетических “книг” уменьшилась в миллион (!) раз, благодаря чему в скором времени соответствующие машины станут в научных и лечебных учреждениях такими же привычными, как компьютерные и магнитно-резонансные томографы. Автоматизация чтения геномов и снижение его индивидуальной стоимости позволит развивать “персональную” медицину и проводить важнейшие генетические исследования в самых широких масштабах.
Подобные исследования позволят, в частности, решить многие сугубо исторические вопросы, связанные с миграцией народов. Можно будет надеяться на решение такой важной проблемы, как этногенез русского народа и другие более мелкие, но от этого не менее важные проблемы.
Журнал “Сайенс” поместил статью о новом лекарстве против меланомы – одной из самых “злых” опухолей. В ходе клинических испытаний препарат показал неслыханную активность у 70 % пациентов. Ученые связывают столь высокую эффективность чрезвычайной “нацеленностью” лекарственного вещества против одного из раковых белков (онкопротеинов), запускающего нерегулируемое деление (пролиферацию) клеток.
Вместе с учеными, опубликовавшими отчет о первом русском геноме, была помещена и статья Е.И.Рогаева и работавших с ним специалистов Института общей генетики им. Н.И.Вавилова и Научного центра психического здоровья, сообщивших о тончайшем молекулярном анализе ДНК царя Николая II, его супруги и их детей. В ходе этого анализа была выявлена истинная молекулярная природа гемофилии В, которой страдал царевич Алексей и “носителем” которой была царевна Анастасия. Оба получили дефектный ген фактора свертываемости крови 1Х (F9) от своей прабабки – британской королевы Виктории. (Для любителей молекулярной точности: произошла точечная мутация, в результате которой сдвинулась “рамка считывания” (начало синтеза ДНК) с заменой одной аминокислоты на другую и последующим преждевременным окончанием синтеза важного белка.) Сами ученые написали о своем открытии весьма сложно на языке, понятном, пожалуй, только специалисту-биохимику: “Мутация активировала криптический (скрытый) сайт сплайсинга, что привело к сдвигу и последующему образованию стоп-кодона”.
Перебрасывая молекулярный “мостик” из нашей трагической истории к светлому медико-молекулярному будущему, можно сказать, что поголовное геномное типирование будущих родителей позволит избежать ситуаций, в которой оказались потомки королевы Виктории. Девушки будут знать, что они несут в своем геноме определенные “поломки”, и во избежание возможных трагедий им опасно зачинать плод мужского пола. В то же время среди мужских потомков Виктории были как больные мальчики, так и совершенно здоровые! Сама королева была здорова, но получила от одного из родителей половую клетку с мутировавшим геном. Быстрый и дешевый геномный анализ позволит врачам и родителям сознательно планировать рождение здоровых и полноценных детей…
* Люцифераза – пигмент, регулирующий окисление люциферина. Люциферины (от лат. lucifer – светоносный) – класс светоизлучающих биологических пигментов, обнаруженных в организмах, способных к биолюминесценции.