Антительная люминесценция,
или молекулярная нанотехнология

В 2008 г. исполнилось ровно сто лет со дня награждения Нобелевской премией выдающегося русского ученого И.И.Мечникова, открывшего первую клетку иммунной системы макрофаг. Вместе с ним в Стокгольм также пригласили и немецкого исследователя П.Эрлиха, открывшего в крови особые белковые “тела”, которые он назвал антителами. Почти через три четверти века, в 1984 г., Нобелевскую премию присудили английским ученым за создание так называемых моноклональных антител (МАТ), которые производятся клетками одного лимфоцитарного клона, поэтому их протеиновые молекулы абсолютно идентичны друг другу. Моноклональность позволяет “оперировать” с одним видом антигенных молекул – в нашем конкретном случае с ароматическим стильбеном.

Энциклопедический словарь дает такое определение люминесценции: “свечение веществ (избыточное над их тепловым излучением при данной температуре), возбужденное к.-л. источниками энергии. Возникает под действием света, радиоактивного и рентгеновского излучений, электрического поля, при химических реакциях и при механических воздействиях. Примеры люминесценции – свечение гниющего дерева, некоторых насекомых, экрана телевизора. По длительности различают флуоресценцию (кратковременная люминесценция) и фосфоресценцию (длительная люминесценция)”. Флуоресценцию словарь определяет еще как затухающую люминесценцию, отличая ее от постоянной фосфоресценции. Далее поясняется, что флуоресценция возникает при спонтанных квантовых переходах молекул или атомов, поэтому ее длительность определяется временем жизни их возбужденного состояния.

Понять все это, конечно, без кандидатской степени в области физических и химических наук непросто, поэтому будем танцевать “от печки”, т.е. от значений латинских слов. Люминесценция, естественно, происходит от слов “люкс”, т.е. свет (отсюда название Луны и “светлого” металла алюминия), а также “люмен” – просвет и “иллюминация” – рассвечивание, освещение. Нетермальное свечение гнилушек и светлячков другой словарь называет биолюминесценцией, отмечая, что в основе этого явления лежат химические, точнее биохимические процессы, а также кристаллические изменения, вызванные возбуждением атомных систем. Вот тут-то мы и возвращаемся к возбужденному состоянию последних и квантовым переходам.

Мы знаем, что электрон можно так “накачать” энергией, что он “сорвется с орбиты” и улетит вдаль, оставив атом в ионизированном состоянии. Но чаще он просто занимает более высокий квантовый уровень, что “переводит” атом в возбужденное состояние, которое продолжается очень и очень недолгое время, после чего электрон, излучая квант энергии, релаксирует – “расслабляется”, возвращаясь на основной, или базовый, уровень. Если испущенный электроном квант имеет частоту видимого света, то мы имеем дело с фотоном, которому соответствует та или иная длина волны видимого света. В технических системах, созданных человеком на заре рождения квантовой физики, квантовые переходы действительно были спонтанными, т.е. неуправляемыми, откуда знаменитые “квантовые скачки” Нильса Бора и получили свое название.

Но живая природа научилась использовать эту спонтанность во вполне желаемом русле не меньше трех миллиардов лет тому назад. Классическим примером является фотосинтез, точнее, стадия улавливания световой энергии солнца в зеленом листе растений. Энергия уловленного фотона “целенаправленно” используется для выбивания электрона магния в молекуле хлорофилла, после чего частице не “дают” релаксировать, а переправляют по каскаду молекул на другую сторону мембраны. Таким образом “заряженный” электрон оказывается по другую сторону фосфолипидной пленки, толщина которой составляет 4 нм. Далее он возвращается по каскаду назад к магнию, но при этом отдает запасенную энергию на фотолиз (светорасщепление) воды, продуктами которого являются токсичный для живых клеток кислород и ионы водорода. Кислород в виде молекул “выбрасывается” в атмосферу, благодаря чему мы имеем возможность дышать, а водород “прокачивается” сквозь внутренний канал молекул аденозинтрифосфатазы (АТФазы), имеющих форму гриба со шляпкой.

Шляпка “молекулярного гриба” находится в постоянном круговом, или ротационном, движении. При повороте ее по часовой стрелке синтезируются молекулы аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ), запасающей в своей концевой связи энергию порядка 10 ккал. Если клетке требуется энергия, то шляпка АТФазы поворачивается в другую сторону, и концевая связь между фосфатными группами (-cвязь) АТФ разрывается, в результате чего энергия высвобождается. Благодаря этим молекулярным циклам жизнь на Земле поддерживается вот уже как минимум три миллиарда лет!

Когда речь заходит о светлячках и гнилушках, необходимо помнить, что имеются в виду прежде всего особые микроорганизмы, содержащие фермент люциферазу (назван в честь падшего ангела Люцифера, имя которого дословно переводится как “светоносный”). Фермент катализирует окисление жироподобного вещества люциферина, и, благодаря высвобождающейся энергии, испускается свет. Нечто подобное происходит в тропических водах морей и океанов, в которых некоторые виды медуз имеют молекулы специфического “зеленого флуоресцирующего протеина”, излучающего свет в зеленом диапазоне (также за счет энергии расщепления АТФ). Сейчас ген медузы вводят в эмбриональные стволовые клетки, чтобы проследить за их “потомством”.

Рассказано все это так подробно потому, что имеет самое непосредственное отношение к теме дальнейшего изложения. Речь идет о получении МАТ, способных избирательно связываться с молекулами производного стильбена, имеющего два ароматических кольца, соединенных друг с другом при помощи двууглеродного мостика с двойной ненасыщенной связью, а также заместитель – довольно длинный “хвост” с двумя “боковыми” кислородами и гидроксильной группой на конце. Не так давно ученые получили люминесцирующие МАТ, испускающие при связывании стильбена голубой свет. Тонкое исследование природы свечения показало, что это не “наведенная” флуоресценция молекулы стильбена, а собственная люминесценция молекулы антитела.

Рентгеноструктурный анализ показал, что МАТ ЕР25 имеет довольно узкий гидрофобный “карман”, в полости которого и происходит связывание линейной молекулы стильбена. ЕР расшифровывается как “эксиплекс”, т.е. возбужденный молекулярный комплекс; его гидрофобность естественна при связывании молекулы стильбена, имеющей два гидрофобных ароматических кольца. При возбуждении молекулы стильбена светом с длиной волны 325 нм энергия поглощается, а затем, в полном соответствии с законами квантовой физики, часть ее возвращается в виде более длинноволнового и, соответственно, менее энергоемкого излучения (450 нм), а часть – рассеивается. Это и есть собственная флуоресценция стильбена, имеющая розовый цвет и практически мгновенно “выключающаяся” после прекращения внешнего освещения.

Однако у “голубого” МАТ ЕР19 карман оказывается на шесть ангстрем глубже – 0,6 нм – и имеет придонное расширение, в которое “устремляется” боковая цепь аминокислоты триптофана, находящегося в 103 положении от начала белковой цепи молекулы антитела (триптофан-103). Особенностью триптофана является наличие в цепи двух колец – пятичленного азот-замещенного и шестичленного ароматического с соответствующими -электронными облаками. К тому же боковой радикал аминокислоты обладает свойствами ротамера, т.е. может свободно вращаться вокруг связи, соединяющей его с полипептидной цепью.

Все это приводит к тому, что, как уже говорилось, боковая цепь триптофана-103 при “появлении” стильбена в кармане связывания поворачивается в его полость, образуя эксиплекс, возникающий между параллельно расположенными электронными облаками стильбена и триптофана, между которыми после освещения ультрафиолетом происходит электронный переход (трансфер). При этом стильбен “жадно” поглощает энергию ультрафиолетовых квантов, что дает ему возможность быстро оторвать электрон боковой цепи триптофана. Два ароматических кольца оказываются в непосредственной близости друг от друга – так называемое -стэкинг-взаимодействие, благодаря которому облегчается быстрый переход заряда.

Следует понимать, что, каким бы сильным ни было взаимодействие двух ароматических групп, естественное тепловое колебание приводит к его разрушению, в результате чего запасенная энергия эксиплекса – порядка 3 эВ – рассеивается в виде яркого и устойчивого голубого свечения. Столь существенная энергия делает эксиплекс мощным окислителем-восстановителем. Его редокс-состояние проверяли с помощью известного акцептора электронов [Co(NH₃)₅Cl]²⁺. Электрон, переходя к стильбену, превращает его в анион-радикал, который быстро окисляется кобальтом, оставляя тем самым катион триптофана-103 без его партнера по электрон-трансферу. Естественно, что это приводит к “гашению” голубого свечения МАТ.

Классическая химия давно знает, что небольшие молекулы кофакторов (вещества, необходимые для каталитического действия фермента) меняют интенсивность и цветность свечения. Однако в 2000 г. было обнаружено, что гигантские комплексы антител могут сами выступать в роли кофакторов, активируя флуоресценцию малых молекул, что позволяет использовать такие МАТ в качестве надежных биосенсоров. Уже сегодня получены комплексы МАТ со стильбеном, светящиеся не только розовым и голубым светом, но даже зеленым. Однако голубые исключительны в своем роде, потому что они светят не за счет стильбена, а за счет интенсивного образования эксиплекса между красителем стильбеном и параллельным его молекуле -облаком боковой цепи триптофана-103, возникающим в самой глубоко расположенной части связывающего кармана.

Ученым даже удалось в результате мутации заменить триптофан другой аминокислотой, а именно фенилаланином, у которого в боковой цепи есть бензольное кольцо, но нет “дополнительного” пятичленного цикла. Связывание стильбена при этом не нарушалось, а вот образования эксиплекса не наблюдали, поскольку на один-полтора ангстрема не хватает длины боковой цепи аминокислоты. Подобное же нарушение происходит и при замене в молекуле МАТ аминокислоты тирозина, которая своим боковым радикалом “прижимает” стильбен к триптофану-103.

Где могут использоваться “светящие” МАТ в качестве биосенсоров? Это прежде всего мечение ДНК, модифицированной с помощью стильбена, хиральных катализаторов, с помощью которых осуществляется стереоспецифический синтез веществ, а также “улавливание” различных стереоизомеров, которые наподобие стильбена могут попадать в карман связывания. С точки же зрения защиты окружающей среды особенно важно то, что МАТ позволяет также уловить присутствие даже незначительных количеств атомов ртути, одного из самых токсичных и распространенных загрязнителей воды, почвы и всего, что окружает нас.

Материал подготовил И.Э.ЛАЛАЯНЦ
(Science, 2008, v. 319, N 5867, р. 1195, 1232)