Развитие
исследований рибонуклеазы

Сейчас на вопрос, что такое белки, каждый старшеклассник уверенно ответит: «Белки – это природные высокомолекулярные органические соединения, построенные из остатков 20 аминокислот, которые соединены пептидными связями в длинные цепи. Относительная молекулярная масса от нескольких тысяч до нескольких миллионов. Белки – основа кожи, шерсти, шелка и других натуральных материалов, важнейшие компоненты пищи человека и корма животных».

Многие знают хотя бы поверхностно об их ключевой роли в жизнедеятельности любых организмов: белки участвуют в построении клеток и тканей, являются биокатализаторами (ферменты), гормонами, дыхательными пигментами (гемоглобины), защитными веществами и др. Более продвинутые знают, что биосинтез белков происходит на рибосомах и определяется генетическим кодом нуклеиновых кислот. А некоторым даже известны рибонуклеазы – ферменты, расщепляющие рибонуклеиновые кислоты путем разрыва фосфодиэфирных связей в полинуклеотидной цепи.

Сейчас специалисты-биохимики знают о белках очень много: как работают ферменты, при участии которых протекают все химические превращения в клетке, как белки управляют действием генов. Им хорошо известно, что только при участии белков осуществляется трансмембранный транспорт, в том числе генерация нервных импульсов, что белки являются неотъемлемой частью иммунной системы, системы свертывания крови, составляют основу костной и соединительной тканей, участвуют в преобразовании и утилизации энергии и т.д.

Все основные процессы в клетке и организме происходят при обязательном участии белков. Белки-ферменты катализируют все биохимические процессы в клетке, поэтому каталитическая (или ферментативная) функция белков является основной. Ферменты являются необходимыми участниками биосинтеза белков, запрограммированного на генетическом уровне, и одновременно с этим белки служат регуляторами генетических функций нуклеиновых кислот.

Механохимическая функция сократительных белков лежит в основе мышечного сокращения. Сократительные белки – это ферменты, в результате каталитической деятельности которых химическая энергия превращается в механическую работу.

Существование клетки и целостного организма требует пространственного разграничения мембранами, которые характеризуются различными проницаемостями. Белки, входящие в состав мембран в комплексе с липидами, обеспечивают активный транспорт как в клетке, так и из нее в направлении против градиента концентрации.

Переходя от клетки к многоклеточному организму, мы встречаем новые специфические функции белков. Белки служат для запасания (примером является миоглобин) и переноса (гемоглобин) кислорода. Эта функция белков сходна с ферментативной, но отличается от нее тем, что молекулярный кислород не испытывает превращений в этих процессах.

Специализированные белки высших организмов – гамма-глобулины – защищают организм от чужеродных биополимеров, выполняя тем самым иммунологическую функцию.

Специальные (фибриллярные) белки входят в состав кожи, костей, волос, сухожилий и выполняют опорную функцию, обеспечивая не жесткую, но надежную взаимосвязь органов, а также их механическую целостность и защиту.

Все это огромное количество информации было получено относительно недавно. Название «белки» впервые было дано веществу птичьих яиц, свертывающемуся при нагревании в белую нерастворимую массу. Позднее этот термин был распространен на другие вещества с подобными свойствами, выделенные из животных и растений. Такие попытки были предприняты еще в XVIII в. Можно сказать, что работы по химическому изучению белков начали французские ученые Ж.Л.Гей-Люссак и Л.Ж.Тенар, которые попытались установить элементный состав белков различного происхождения и сделали вывод о том, что все белки сходны по набору элементов, входящих в их состав. Если бы они тогда знали, что только в бактерии кишечной палочки присутствует более 3 тыс. различных белков!

Первую теорию строения белковых веществ предложил в 1836 г. голландский химик Г.Я.Мульдер. Он предположил, что все белки имеют некий гипотетический радикал (С₄₀H₆₂N₁₀O₁₂), связанный в различных пропорциях с атомами серы и фосфора. Мульдер назвал этот радикал протеином (от греч. – первый, главный). Теория Мульдера интересна, пожалуй, теперь только историкам науки, а вот обиходное название белков – протеины – сохранилось и поныне. Тем не менее интерес к изучению белков и совершенствованию методов белковой химии пробудился. Были разработаны приемы выделения белков путем экстракции растворами нейтральных солей, впервые белки были получены в кристаллической форме. Становилось ясно, что белки выполняют определенные функции в живых организмах.

Одну из важнейших функций белков установил Й.Я.Берцелиус, который в 1837 г. первым высказал предположение о том, что они играют роль биокатализаторов. Несколько позднее Ю.Либих подтвердил это на примере спиртового брожения глюкозы, показав, что дрожжи являются катализатором этого процесса. От латинского слова «fermentum» – закваска – и произошло название веществ, выполняющих роль катализатора в живых организмах, их назвали ферментами. Любопытно, что от другого их названия – энзимы, которое нынче почти вышло из употребления, – произошло слово «энзимология» – учение о ферментах.

Почти все ферменты являются белками (в последние годы стало известно, что некоторые молекулы РНК имеют свойства ферментов). Но не все белки – ферменты. Представление о том, что ферменты – белки, утвердилось не сразу. Для этого нужно было научиться выделять их в высокоочищенной кристаллической форме. Впервые фермент в таком виде выделил в 1926 г. Дж.Самнер. Этим ферментом была уреаза, которая катализирует расщепление мочевины в живых организмах. Потребовалось еще около 10 лет, в течение которых было получено еще несколько ферментов в кристаллической форме (пепсин, Дж.Х.Нортроп, 1929 г.), лизоцим (Э.П.Абрахам, Р.Робинсон, 1937 г.), чтобы представление о белковой природе ферментов получило всеобщее признание.

Считалось, что различие в функционировании белков отражает различие в их молекулярной структуре. Объективная логика развития биохимии поставила на повестку дня изучение первичной структуры белков. Еще в начале XX в. немецкий химик Э.Г.Фишер впервые применил методы органической химии для изучения белков и доказал, что белки состоят из -аминокислот, связанных между собой амидной (пептидной) связью, образующейся при конденсации карбоксильной и аминогруппы:

Первичной структурой, или аминокислотной последовательностью, белков стали называть порядок расположения ковалентно связанных остатков аминокислот в полипептидной цепи. Потенциально возможное число белков, которые могут образоваться из 20 аминокислот, практически не ограничено.

Оставался открытым важнейший вопрос: несет ли в себе первичная структура белка всю информацию, необходимую для формирования биохимически активных структур более высокого уровня? Представим себе, что это действительно так.

Вот как образно трактуют эту ситуацию отечественные исследователи Л.Б.Меклер и Р.Г.Идлис: «Все хорошо знают, что для того чтобы связать свитер, многоцветный или одноцветный, фигурный или простой, шерстяной или синтетический, недостаточно иметь соответствующие нитки. Необходим также и план желаемого конечного продукта – скажем, свитера, в воображении художника или в виде соответствующей программы компьютера, управляющего соответствующей вязальной машиной, т.е. нитки и детали этих машин нужны сами по себе, а план изделия, изготавливаемого из этих ниток или деталей, – сам по себе. Принципиальное отличие реализации подобного процесса Природой состоит в том, что информация, необходимая для построения (вязания) Природой биологических микромашин – трехмерных молекул белков из их полипептидных цепей-ниток, – записана в самих этих нитках! И реализация этой информации не нуждается ни в каких компьютерах».

Но для того, чтобы подтвердить или опровергнуть это, требовались кропотливые усилия ученых. Так структурные исследования белков оказались в центре внимания биохимиков.

Разработка программы этих исследований была начата в США еще во время второй мировой войны в связи с фракционированием белков плазмы крови. После войны биохимические подходы стали играть большую роль в изучении целого ряда заболеваний: нарушения обмена веществ, заболевания сердца, сосудов (рак, аллергия, сердечнососудистая патология).

В поле зрения исследователей попал фермент рибонуклеаза – один из многих тысяч органических катализаторов, которые регулируют химические реакции в живых организмах, занимающий тем не менее одно из центральных мест в метаболизме живой клетки. Кроме того, оказалось, что рибонуклеаза представляет чрезвычайно удобный объект для подобного исследования – ее относительная молекулярная масса составляет всего около 15 тыс.

Актуальность исследований подтверждается, например, тем фактом, что одна из крупнейших пищевых корпораций в Чикаго изготовила в начале 1950-х гг. около 1 кг высокоочищенного препарата панкреатической рибонуклеазы и предложила его биохимикам всего мира. Откликнулись те исследователи, которые уже так или иначе были связаны с проблемой расшифровки структуры белков. Это были американские биохимики К.Б.Анфинсен, С.Мур и У.Х.Стайн.

Стайн уже провел анализ аминокислот, обнаруженных в самых разнообразных белках. За диссертацию, посвященную аминокислотному содержанию белка эластина, ему в 1938 г. была присуждена докторская степень. В 1939 г. над методом определения аминокислотного состава белков стал работать и Мур. Это произошло в лаборатории М.Бергмана, которая в те времена была известным международным центром исследований химии белков и ферментов. Здесь встретились и начали сотрудничать Мур и Стайн.

Анфинсен в 1943 г. описал свои исследования по разработке методов измерения активности ферментов, находящихся в сетчатке глаза. Когда он приступил к этой работе, было уже известно, что цепочка из аминокислот скручена в трехмерную сферическую форму. Предполагалось, что каждый тип белка скручен, хотя и неизвестно, каким образом, и принимает определенную, только для него характерную форму, которая связана с его функцией (рис.1). В середине 1940-х гг. Анфинсен и его коллега Д.Штейнберг начали исследовать процесс включения аминокислот, меченных изотопами, в белки.

Когда в 1952 г. первый научный руководитель Анфинсена К.Линдерштрем-Ланг выступил с принципиально новой концепцией об иерархической структуре белков (первичная, вторичная и третичная структуры белковой молекулы), Анфинсен оказался в его Карлсбергской лаборатории в Копенгагене. Здесь и появилась первая работа Анфинсена по анализу первичной структуры рибонуклеазы быка – фермента, состоящего из 124 аминокислот и синтезирующегося в поджелудочной железе.

Стайн и Мур исследования структуры рибонуклеазы начали вместе. Получив в свое распоряжение лабораторию, ученые приступили к исследованиям в 1945 г. Первой стадией исследования всех белков, включая рибонуклеазу, явились выделение и очистка. На вооружение они взяли перспективный тогда метод разделения и очистки белка – метод бумажной хроматографии, разработанный годом раньше английскими химиками А.Мартином и Р.Сингом. Он оказался очень эффективным для решения биохимических проблем, связанных с разделением аминокислот.

Дело в том, что после расщепления полипептидной цепи на составляющие ее аминокислоты их можно отсортировать благодаря характерным скоростям, с которыми те продвигаются по специальной фильтровальной бумаге. Мартин и Синг обнаружили, что таким образом можно разделить практически все известные аминокислоты. Начало работ по рибонуклеазе совпало с блестящими достижениями выдающегося английского биохимика Ф.Сенгера, ранее предложившего метод динитрофенилирования для определения N-концевых групп в полипептидных цепях, что позволило преодолеть значительные трудности в разделении и исследовании продуктов гидролиза белков. Сенгер применил метод бумажной хроматографии для выяснения вида аминокислот и их количественного соотношения в инсулине, что дало ему возможность позднее (1955 г.) расшифровать строение этого гормона¹.

Применение метода бумажной хроматографии открывало возможность получения полезных данных, касающихся аминокислотного состава. Тем не менее Мур и Стайн занялись поисками метода разделения, который обеспечил бы большее количество информации о каждой из аминокислот. И здесь они учли мнение маститого ученого: Сенгер предложил им применить метод колоночной хроматографии, при котором анализируемый раствор пропускается через трубку с веществом, поглощающим компоненты раствора с различной скоростью. Результаты этого поглощения можно наблюдать в виде четких полос в адсорбирующей насадке колонки (рис. 2).

В 1948 г. Мур и Стайн впервые определили аминокислотный состав белка. В качестве наполнителя в колоночной хроматографии они первыми использовали картофельный крахмал. Процесс оказался достаточно трудоемким, для получения результата требовалось не менее двух недель, и ученые приступили к поискам более эффективного метода. Такой метод был найден.

Большой вклад в его развитие внесли Мур и Стайн. Получение белков в высокоочищенном и индивидуальном виде стало возможным главным образом благодаря ионообменной хроматографии на колонках. В начале 1950-х гг. они уже освоили метод ионообменной хроматографии, при котором ионообменная смола отсортировывает ионы в соответствии с их электрическими зарядами и размерами. Этот метод не только позволил ускорить аналитический процесс, но и обеспечил более четкое разделение, чем метод колоночной хроматографии с использованием крахмала. Сочетая оба метода, Мур и Стайн осуществили анализ аминокислот, входящих в состав различных белков. В 1954 г. они опубликовали данные об аминокислотном составе фермента рибонуклеазы. Было установлено, что рибонуклеаза состоит из 124 аминокислотных остатков, а относительная молекулярная масса ее равна 13 683.

Точное знание, какие именно аминокислоты входят в состав белка, – необходимое условие для дальнейших исследований. Так, например, Дж.Ингрэм, получивший в 1956 г. первые пептидные карты («фингерпринты» – «отпечатки пальцев»), показал, что различия гемоглобина больных серповидноклеточной анемией и нормального гемоглобина обусловлены заменой одной-единственной аминокислоты в его молекуле.

Анфинсен работал в этом же направлении независимо от Мура и Стайна. Тем не менее и он начал с того, что также применил методы Сенгера в своих исследованиях. Анфинсен считал, что для понимания взаимосвязи структуры и функции ферментов необходимо изучить процесс их сборки в живых организмах. Он предполагал, что если будет синтезировать цепочку аминокислот, последовательно присоединяя их одну за другой, и измерять ее активность после каждой стадии, то сможет точно определить взаимосвязь между свойствами фермента и аминокислотной последовательностью. Однако очень скоро Анфинсен понял, что исследовательская группа, возглавляемая Муром и Стайном, способна определить аминокислотную последовательность фермента раньше, чем это сделает он сам.

Тем не менее проигрывать научное соревнование Анфинсену не хотелось. Тогда он решил поставить вопрос шире: не только пытаться синтезировать рибонуклеазу по «кирпичикам», но и провести наблюдение за молекулой фермента в различных условиях.

Продолжим сравнение, предложенное Меклером: «Американский физикохимик К.Анфинсен… в результате поиска ответа на вопрос, в чем состоит, каким образом и где записана информация, согласно которой формируются трехмерные молекулы белков, поставил простой, прямой и однозначный эксперимент. Объект этого эксперимента – рибонуклеаза… Именно эту рибонуклеазу – работающую биологическую микромашину – Анфинсен и его сотрудники распустили до нитки, из которых эту трехмерную микромашину Природа связала. Точно так же, как распускают свитер, превращая его в моток нитей, из которого затем снова вяжут или такой же свитер, или что-либо иное. Как же они достигли этой цели? Очень просто: растворили этот фермент в концентрированном растворе гуанидинхлорида – соединения, разрывающего все те водородные связи и вандерваальсовы контакты между аминокислотными остатками полипептидной цепи, возникновение которых и приводит к превращению нитки полипептида в трехмерную работающую биологическую микромашину. А затем эти спутанные друг с другом клубки нитейполипептидов (денатурированную рибонуклеазу) опустили в обычный водно-солевой раствор. И этого простого действа оказалось достаточно, чтобы совершилось волшебство: буквально на глазах у зрителей за считанные минуты эти клубки спутанных нитей-полипептидов превратились не во что-либо иное, а именно в ту же мириадную армию (примерно 10¹⁷ копий-близнецов в миллилитре!) исходных трехмерных, снова работающих биологических микромашин, так же, как и ранее, расщеплявших РНК на мономеры-звенья, из которых эти биополимеры построены».

Строго говоря, Анфинсен сделал следующее: он денатурировал рибонуклеазу, химически разрушив содержащиеся в ней четыре дисульфидные связи. Получилась хаотически скрученная цепочка аминокислот. И тогда им был установлен очень важный факт: при переводе такой неупорядоченной структуры в химическую среду, близкую к физиологическим условиям, ее активная третичная структура постепенно восстанавливается.

И все же основной стадией в структурных исследованиях рибонуклеазы было определение ее аминокислотной последовательности. Соединение хроматографических методов анализа с фотометрическим нингидринным² методом Мура и Стайна и их же автоматическим коллектором фракций привело к созданию методики, позволяющей анализировать белковый гидролизат в течение двух недель. В 1950-е гг. это время сократилось до одной недели, чему способствовало применение синтетических ионообменников – сульфокатионитов. (Забегая вперед, отметим, что к 1968 г. процесс был автоматизирован и ускорен. Короткие колонки и быстрые скорости позволили уменьшить время анализа до нескольких часов, а в настоящее время есть системы, осуществляющие в течение 1 часа полный анализ с автоматическим расчетом количеств аминокислот в образцах, содержащих до нескольких наномолей аминокислот.)

Предварительные результаты исследований структуры рибонуклеазы были опубликованы Анфинсеном в 1956 г. Учитывая эти данные, Стайн и Мур с помощью метода ионообменной хроматографии выделили высокочистые образцы этого фермента. Разрушив химические связи в белке и получив смесь из 15 пептидов, они разделили пептиды, применив метод хроматографии, и установили последовательность чередования аминокислот. Процесс разделения существенно ускорился, когда в 1958 г. Стайн и Мур вместе с Д.Спэкманом разработали автоматический метод аминокислотного анализа, прочно занявший место в арсенале биохимиков.

И вот наконец перед ними полная схема первичной структуры рибонуклеазы. В 1960 г. она была опубликована. Это была вторая из установленных белковых последовательностей и первая из последовательностей в молекуле фермента. Благодаря полученным ими результатам Муру и Стайну удалось определить местоположение и состав компонентов активного центра рибонуклеазы, который катализирует расщепление РНК. Их работы по первичной структуре рибонуклеазы помогли в дальнейшем установить третичную структуру этого фермента, изучить механизм его действия, а также явились необходимой предпосылкой осуществленного в группе Р.Б.Меррифилда полного химического синтеза рибонуклеазы³.

Научное соревнование продолжалось. Исследования становились все более сложными. Анфинсен основное свое внимание концентрирует на остатках цистеина и их роли во вторичной структуре фермента. Он точно устанавливает, что молекула его состоит из одной длинной полипептидной цепи, образующей «складки», скрепленные дисульфидными мостиками. В ходе исследований в лаборатории Анфинсена разрабатываются новые методы. Широкую известность получил метод гидролиза окисленной рибонуклеазы трипсином с предварительным блокированием -аминогрупп лизина, метод развертывания полипептидной цепи с помощью восстановления связей S–S тиогликолевой кислотой, а также широко используемый ныне метод хроматографии ферментов на фиксированных аналогах субстратов. На рис. 3 показаны лишь несколько достаточно упрощенных молекулярных моделей некоторых ферментов. Но и они дают возможность оценить всю сложность работы, связанной с установлением их структуры.

Рис. 3. Модели молекул различных ферментов – молекулярных машин

К 1962 г. Анфинсен завершил физико-химическое исследование рибонуклеазы. В соответствии с точкой зрения ученого третичная структура активной рибонуклеазы формируется в результате перегруппировки аминокислот, обладает наименьшей энергией, т.е. является наиболее стабильной. В этом заключалась так называемая «термодинамическая гипотеза» ученого. Действительно, он установил, что только одна аминокислотная последовательность определяет и третичную структуру фермента, и его функциональную активность.

Вместе с тем оставалось неясным, вся ли молекула фермента отвечает за активность или только ее часть. Новые эксперименты и их углубленный анализ приводят ученого к окончательному выводу: «Активность фермента, выражающаяся в его способности катализировать некую определенную реакцию, не следует связывать со всей его структурой». Выступив с перспективным утверждением о том, что «полное объяснение процесса видообразования следует искать в структуре белков», он предлагает совершенно новую трактовку процесса биологической эволюции: одна аминокислотная последовательность строго необходима для выполнения определенной каталитической функции и жестко сохраняется в эволюции, другая же, не имея столь важного функционального значения, сохраняется лишь как химический рудимент ранее существовавших молекул.

В 1972 г. Анфинсену вручена половина Нобелевской премии «за работы по рибонуклеазе, в частности за установление связи между последовательностью аминокислот и конформацией биологически активной молекулы». Мур и Стайн разделили вторую часть премии «за их вклад в прояснение связи между химической структурой и каталитическим действием активного центра молекулы рибонуклеазы».

Научный интерес к рибонуклеазе не утихает. Выяснилось, например, что этот белок разрушает опухолевые клетки, не нарушая функцию здоровых. Как известно, рибонуклеаза в норме существует в организме человека, однако ее активность резко снижена у больных онкологическими заболеваниями. Недавно американские ученые Р.Вагнер и Д.Липовчек применили методы генной инженерии для модификации белка-фермента рибонуклеазы. Новым прорывом в борьбе с раком назвали они свои разработки.

Блестящие успехи молекулярной биологии, достигнутые за несколько предыдущих десятилетий, были отмечены множеством Нобелевских премий. Благодаря работам лауреатов в настоящее время ученые понимают, каким образом на молекулярном уровне работает универсальная регуляторная система клетки, которая управляет синтезом белков, трансляцией ДНК, транскрипцией генов и «контролем качества» вновь синтезированных белков. Биология в целом и молекулярная биология в особенности по стремительности своего развития далеко обогнали и математику, и физику, и химию. Сегодня при наличии соответствующего оборудования расшифровка химических структур уже не представляет труда и за эту работу не присуждают Нобелевских премий.

В результате ученые умеют очень быстро читать любые генетические тексты в виде линейной последовательности нуклеотидов и аминокислот. Но расшифровывать их с тем, чтобы понять, как Природа формирует работающие биологические микромашины – гормоны, ферменты, белки-транспортеры, белки мышц, белки иммунной системы организма и т.д., – пока не умеют. Зная строение линейных полипептидных цепей и даже строение трехмерных молекул белков, т.е. пространственную структуру (что гораздо сложнее – ее определяют, используя мощные и дорогостоящие физические методы: рентгеноструктурный анализ, ядерный магнитный резонанс, электронную микроскопию), пока не удается понять, как трехмерные молекулы белков формируются из линейных полипептидных цепей.

Даже американский ученый К.Э.Дрекслер – первый человек, получивший докторскую степень в области молекулярной нанотехнологии, – не склонен к радужному оптимизму: «Попытка предсказать, как цепь будет сворачиваться, подобна попытке разгадать кроссворд, но кроссворд без пропечатанной формы, которая бы позволяла определить, правилен ли ответ, и с частями, которые могут соответствовать друг другу почти так же хорошо (или плохо) многими различными способами, но все, кроме одного из них, – неправильные. Неправильное начало может занять большую часть времени жизни, а правильный ответ так и не будет распознан. Биохимики, используя лучшие компьютерные программы, имеющиеся на сегодняшний день, все же не могут предсказывать, как длинный естественный белок будет на самом деле сворачиваться, и некоторые из них уже отчаялись научиться разрабатывать молекулы белка в ближайшем будущем».

* * *

АНФИНСЕН Кристиан Бемер (26.III.1916 – 14.V.1995) родился в Монессене, промышленном городке близ Питтсбурга (США, штат Пенсильвания). Его назвали в честь отца, иммигрировавшего в США из Норвегии (как и его мать София). Окончив местную школу, Кристиан поступил в Свортмор-колледж, где в 1937 г. ему была присвоена степень бакалавра. Там он увлекся органической химией, изучение которой продолжил в Пенсильванском университете, одновременно выполняя обязанности помощника преподавателя.

В 1939 г. Кристиан получил степень магистра, а в следующем году поехал в Данию как стипендиат Американо-cкандинавского фонда. Работал в Карлсбергской лабораториии в Копенгагене под руководством физикохимика К.Линдерштрема-Ланга. Тот помог Анфинсену по-новому взглянуть на ферменты, «лишив эти органические соединения, – как писал впоследствии Анфинсен, – эти большие некристаллические макромолекулы завесы таинственности».

Вернувшись в 1940 г. в США, Анфинсен получил стипендию в Гарвардском университете. Три года спустя там же ему присуждается степень доктора по биохимии, и он становится преподавателем факультета биологической химии в Гарвардской медицинской школе в Бостоне. В 1944–1946 гг. служил по гражданскому найму в Управлении научно-исследовательских и опытно-конструкторских работ США. В 1947/48 г. был младшим исследователем Американского онкологического общества при биохимическом отделении Нобелевского института в Швеции, где работал под руководством биохимика, нобелевского лауреата по физиологии и медицине 1955 г. А.Х.Т.Теорелля.

После возвращения в США Анфинсен стал адъюнкт-профессором в Гарварде, однако вскоре оставил этот пост и возглавил лабораторию клеточной физиологии при Национальном кардиологическом институте, входящем в состав Национального совета здравоохранения в г. Бетесде (штат Мэриленд).

В середине 1950-х гг. Анфинсен продолжил свои исследования, изложенные в докторской диссертации, по разработке методов измерения активности ферментов в живых организмах. Он поставил себе цель: выяснить, как ферменты контролируют огромный набор известных биохимических реакций – ведь в то время еще никто не определил полную аминокислотную последовательность какого-либо фермента. Академический 1954/55 г. он снова провел в Карлсбергской лаборатории. Анфинсен решил, что для понимания связи «структура–функция» необходимо изучить процесс сборки ферментов в живых организмах. Так началась работа по исследованию рибонуклеазы. К 1962 г. Анфинсен завершил ее и стал профессором биохимии в Гарвардской медицинской школе, но в следующем году переехал в Бетесду и возглавил лабораторию химической биологии в Национальном институте артрита, метаболизма и заболеваний пищеварительной системы. Здесь в 1960-е гг. он изучал структурно-функциональные взаимосвязи многих белков.

После получения Нобелевской премии в 1972 г. Анфинсен заинтересовался интерфероном – белком, который играет ключевую роль в защите организма от вирусов и рака. Выделив это вещество, он предпринял серию исследований по изучению его структуры и свойств. С 1982 г. Анфинсен занимал пост профессора биологии в Университете Джона Хопкинса.

Анфинсен был членом совета Вейцмановского института наук в Реховоте (Израиль), членом Американского общества биохимиков, американской Национальной академии наук и Датской королевской академии. В 1954 г. он получил премию гражданской службы Рокфеллеровского фонда. Ему присвоено звание почетного доктора Свортмор-колледжа, Нью-Йоркского медицинского колледжа, а также университетов в Джорджтауне и Пенсильвании.

В 1941 г. Анфинсен женился на Ф.Кененджер; у них родилось трое детей: две дочери и сын. В 1978 г. супруги разошлись. В следующем году Анфинсен женился на Л.Шульман-Эли. На досуге ученый занимался парусным спортом, любил слушать классическую музыку.

* * *

МУР Станфорд (04.IX.1913 – 23.VIII.1982) родился в Чикаго (США, штат Иллинойс) в семье Дж.Х.Мура и Р.Мур. Вскоре после рождения сына родители переехали в Нашвилл (штат Теннесси), где его отец преподавал право в Вандербилтском университете. В семье Муров царила атмосфера, располагающая к интеллектуальным занятиям, и Станфорд рано проявил интерес к химии, а его учитель в средней школе способствовал развитию этого интереса. Поступив в 1931 г. в Вандербилтский университет, Мур колебался между химией и авиационной инженерией, однако после занятий под руководством А.Ингерсолла остановил свой выбор на органической химии.

Получив в 1935 г. степень бакалавра summa cum laude (с наивысшей похвалой – лат.), Мур был удостоен стипендии Научно-исследовательского фонда выпускников Висконсинского университета, благодаря которой он получил возможность продолжить учебу в этом университете. Здесь он написал работу под руководством К.П.Линка, который незадолго до этого работал в Европе вместе с Ф.Преглем над микроаналитическими способами установления атомной структуры органических соединений. За диссертацию, посвященную характеристике углеводов и производных бензимидазола, Мур в 1938 г. получил докторскую степень.

Эта работа оказалась настолько значительной, что Линк рекомендовал молодого ученого немецкому химику М.Бергману, незадолго до этого прибывшему в США, чтобы работать в Рокфеллеровском институте медицинских исследований (ныне Рокфеллеровский университет) в Нью-Йорке. Бергман, в прошлом помощник Э.Фишера, был тогда одним из наиболее выдающихся ученых в области химии белка. Он пригласил Мура работать в Рокфеллеровском институте над методом определения аминокислотного состава белков. Под руководством Бергмана в 1939 г. и началась наиболее плодотворная деятельность Мура. Одним из его коллег по работе над этой темой стал еще один талантливый американский биохимик – У.Х.Стайн.

В 1941 г. США вступили во вторую мировую войну, и Мур оказался в армии. Он взял в Рокфеллеровском институте отпуск и служил в качестве младшего офицера в Управлении научных исследований и развития США. Позднее он был направлен в оперативный научно-исследовательский отдел вооруженных сил на Гавайских островах.

Когда в 1945 г. Мур вернулся из армии, профессора Бергмана уже не было в живых, и будущее, ожидавшее ученого в Рокфеллеровском институте, представлялось крайне неопределенным. Однако директор института Г.С.Гассер предложил Муру и Стайну возобновить ранее начатую работу над количественным анализом аминокислот. Положительные результаты были получены ими в 1948 г. В 1950 г. Мур прервал работу и провел сначала полгода в Свободном университете Брюсселя, а затем еще столько же в Англии, работая с Сенгером в Кембриджском университете. После возвращения в Рокфеллеровский институт он с новыми силами принялся за работу со Стайном. К 1960 г. они установили полную последовательность чередования аминокислот в молекуле рибонуклеазы. Проведя 1968 г. в качестве приглашенного профессора медицины в медицинской школе Вандербилтского университета, Мур возвратился в Рокфеллеровский институт, где он и Стайн контролировали аналитические исследования дезоксирибонуклеазы – фермента, расщепляющего дезоксирибонуклеиновую кислоту.

В 1972 г. Муру и Стайну была присуждена половина Нобелевской премии по химии. Во вступительной речи от имени Шведской королевской академии наук Б.Г.Мальстрем отметил, что понимание каталитического действия фермента зависит от установления местоположения его активного участка. «Благодаря этим исследованиям, – подчеркнул он, – удалось создать подробную картину активного участка рибонуклеазы задолго до того, как была установлена трехмерная структура этого фермента».

После получения Нобелевской премии Мур продолжал заниматься исследованиями ферментов в Рокфеллеровском институте. Помимо Нобелевской премии, Мур и Стайн получили награду за достижения в области хроматографии и электрофореза (1964) и медаль Т.У.Ричардса (1972) Американского химического общества. Ученый был обладателем почетных степеней университетов Брюсселя и Парижа, являлся членом Американской ассоциации содействия развитию науки, американской Национальной академии наук, Американского химического общества, Американского общества биологической химии и Американской академии наук и искусств.

Мур не был женат, всего себя отдавал научно-исследовательской деятельности в области биохимии, твердо веря в те преимущества, которые она несет. «Знание человеком человека, – говорил он в то время, когда ему была присуждена Нобелевская премия, – имеет даже более высокий приоритет в исследованиях, чем знание человеком Вселенной». Однако тяжелое прогрессирующее заболевание центральной нервной системы привело к тому, что ученый покончил с собой в своем доме в Нью-Йорке в возрасте 68 лет.

* * *

СТАЙН Уильям Хоуард (25.VI.1911 – 02.II.1980) родился в Нью-Йорке. Он был вторым из трех детей Беатрис Стайн и бизнесмена Ф.М.Стайна. Уильям учился в школе Линкольна – прогрессивном учебном заведении при учительском колледже Колумбийского университета. Заканчивая школу, он одновременно посещал занятия в академии Филипс-Экзетер в Андовере (CША, штат Массачусетс).

В 1929 г. Стайн поступил в Гарвардский университет. Однако после получения степени бакалавра по химии его дальнейшие успехи оказались более чем скромными. Будущий ученый был на грани того, чтобы бросить занятия. Неизвестно, что послужило причиной, но Стайн решил переключиться на биохимию; в 1934 г. перешел в расположенный в Нью-Йорке Колледж врачей и хирургов Колумбийского университета и нашел здесь те стимулы для интеллектуальной деятельности, которых ему не хватало. За диссертацию, посвященную аминокислотному содержанию белка эластина, ему в 1938 г. была присуждена докторская степень. Хотя структура эластина в то время еще оставалась неясной, диссертация Стайна оказалась существенным шагом к ее пониманию. Уже после получения докторской степени Стайн проявил желание попытаться разработать более эффективные способы анализа аминокислот в белках. Тогда-то он и начал работать в Рокфеллеровском институте медицинских исследований в Нью-Йорке и был определен в одну группу с С.Муром. О своем новом руководителе – М.Бергмане – он позднее отзывался как «об одном из самых великих специалистов XX столетия в области химии белка».

Во время второй мировой войны Стайн, хотя его и не призвали в армию, как Мура, работал над связанными с военными целями проектами для Управления научных исследований и развития США. В 1945 г. после смерти Бергмана и окончания войны оба ученых продолжили ранее начатые исследования в области количественного анализа аминокислот.

Стайн в 1954 г. стал полным профессором Рокфеллеровского университета. К этому времени он уже провел анализ аминокислот, обнаруженных в самых разнообразных белках. Впрочем, основные усилия были сосредоточены на ферменте рибонуклеазе, одном из многих тысяч органических катализаторов, которые регулируют химические реакции в живых организмах. Так началось научное противоборство Анфинсена, с одной стороны, и тандема Мур–Стайн – с другой. Совместными усилиями они внесли существенный вклад в прояснение связи между химической структурой и каталитическим действием активного центра молекулы рибонуклеазы. В 1972 г. Стайну и Муру была присуждена половина Нобелевской премии по химии, второй половины премии был удостоен Анфинсен. «На базе знаний структуры больших ферментов, – заявили Стайн и Мур в их совместной нобелевской лекции, – получат развитие основополагающие принципы понимания того, как по замыслу природы катализаторы служат определенным целям».

Стайн сотрудничал с Муром не только в этой области. Помимо рибонуклеазы они также исследовали структуру и функции панкреатической дезоксирибонуклеазы – фермента, который гидролизует молекулу ДНК. Интерес Стайна к разной научной информации способствовал тому, что ученый посвящал значительную часть своего времени «Журналу биологической химии» (Journal of Biological Chemistry), где с 1958 г. по 1971 г. прошел путь от редактора и члена редакционного совета до главного редактора.

Мур отзывался о нем как о «плодотворном и блестящем биохимике». В 1968 и 1969 гг. Стайн был председателем Государственного комитета по биохимии США. Ученый являлся попечителем больницы Монтефиор и входил в консультативный Медицинский совет медицинской школы Хадасса Еврейского университета.

В 1936 г. Стайн женился на Ф.Хокстейдер. У супругов было три сына. В 1969 г. ученый тяжело заболел. Несмотря на то, что развившийся паралич до конца жизни приковал его к креслу-каталке, Стайн сохранил живой интерес к научным исследованиям.

¹ Работа заняла 11 лет. Сенгер определил расположение 51 аминокислоты в молекуле гормона и показал, что она состоит из двух цепей, соединенных дисульфидными связями.

² Нингидринная реакция – метод обнаружения и количественного определения свободных аминокислот и иминокислот, основанный на химической реакции образования ими в щелочной среде окрашенного комплекса с нингидрином; используется в лабораторной практике при анализе белков и пептидов после их гидролиза.

³ Роберт Брюс Меррифилд – американский биохимик (род. 15 июля 1921 г.). В 1969 г. вместе с Б.Гутте завершил первый успешный синтез фермента рибонуклеазы, являющегося предметом исследований в Рокфеллеровском институте уже более 30 лет. Метод Меррифилда предусматривал осуществление 369 химических реакций и 11 931 отдельной стадии, для чего требовалось несколько недель непрерывной работы твердофазного синтезатора. Нобелевская премия по химии, 1984 г.

Л и т е р а т у р а

Основы биохимии. Пер. с англ. М., 1981, т. 1; Степанов В.М. Молекулярная биология. Структура и функция белков. М., 1996; Проблема белка. М., 1995, т. 1–5; Белки и пептиды. М., 1995–2000; The Proteins. New York, 1975–1979, 3 ed., v. 1–4. The ribonucleases – occurrence, structure and properties. Enzymes. New York, 1961, v. 5; Лауреаты Нобелевской премии. Энциклопедия. Пер. с англ. М.: Прогресс, 1992.

А.Б.ЗАЧЕРНЮК