ПЦР НОВОГО МИЛЛЕНИУМА

В конце июля 2004 г. в Калифорнии скончался от рака Фрэнсис Крик, сооткрыватель двойной спирали ДНК, который как-то туманным мартовским утром 1953 г. заявил всем собравшимся в пивной «Игл» («Орел»), что в самом центре Кембриджа: «Мы открыли секрет жизни!» Примерно через месяц, 25 апреля, в журнале «Nature» было опубликовано письмо Фрэнсиса Крика и Джеймса Уотсона редактору журнала, в котором был помещен рисунок жены Крика, изображавший двойную спираль ДНК. Скромный рисунок обошел потом все издания мира.

Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крик у модели ДНК в Кавендишской лаборатории, Кембридж, 1953 г.

Письмо стало поводом впоследствии присудить Уотсону и Крику Нобелевскую премию по физиологии и медицине за 1962 г. А через пару лет Фрэнсис Крик и Сидней Бреннер (также лауреат этой престижной награды, но 2002 г.) расшифровали генетический код, состоящий из троек нуклеотидов, которые триплетами своих азотистых оснований кодируют аминокислоту в белках. Так началась эра молекулярной биологии, ознаменовавшаяся в самом начале нового миллениума «прочтением» всего генома человека, содержащего почти три миллиарда нуклеотидов, или три тысячи мегабаз.

Никто поначалу и думать не мог, что геном будет прочитан за какую-то дюжину лет. Этому способствовало создание Кэрри Муллисом (лауреат Нобелевской премии по химии за 1993 г.) так называемой ПЦР, или полимеразной цепной реакции.

Напомним, что полимераза – это фермент, который «полимеризует», или синтезирует, нуклеиновые кислоты, в частности ДНК. Цепная же реакция на то и цепная, что ее продукт – исходный материал для следующего цикла. В данном случае речь идет о синтезе ДНК на основе ранее синтезированной ДНК. Но для начала синтеза нуклеиновых кислот необходима так называемая затравка.

Затравку можно сравнить с названием книги или ее первой строкой: «Все смешалось в доме Облонских...», «Мой дядя самых честных правил...» и т.д. Наличие затравки позволяет ферменту скопировать весь отрезок ДНК.

Сейчас в распоряжении ученых автоматические «амплификаторы», которые синтезируют миллионы копий ДНК для анализа, без чего невозможно «прочтение» гена. Цикл амплификации состоит из трех стадий. На первой стадии раствор с ДНК нагревают до 95 °С, что приводит к разрыву водородных связей между парами азотистых оснований и расплетанию двух цепей ДНК. Затем раствор охлаждают до 50 °С и добавляют в него затравку, которая связывается с комплементарным началом цепи, т.е. аденин соединяется с помощью водородных связей с тимином противоположной цепи, а гуанин – с цитозином. После связывания затравок идет нагрев до 72 °С, в результате чего активная полимераза синтезирует нужную последовательность.

У «добропорядочного» химика тут же может возникнуть вопрос: а как же не денатурируется при такой высокой температуре белок? Ведь фермент имеет протеиновую природу, а белок денатурируется при температуре чуть выше 40 °С! Никакого нарушения законов природы тут нет, скорее именно природа и помогла химикам это понять.

Не так давно в глубинах океанов были открыты так называемые каминные трубы, представляющие собой выходы на поверхность океанического дна горячих источников, температура воды в которых достигает чуть ли не сотни градусов. Как ни странно, вокруг таких каминных труб в полном отсутствии света бурлит и развивается своеобразная «горячая» жизнь, начинающая свои пищевые цепи с микрофлоры горячих источников.

Один из микробов «термического обжига» получил у специалистов название, означающее «горячелюбивый водный». Естественно, что и в его клетках идет синтез ДНК, поэтому его ДНК-полимераза очень устойчива к нагреванию. Выделенная из его клеток полимераза получила сокращенное название Таq (сокращение от видового названия микроорганизма).

Полимераза Таq позволила автоматизировать процесс ПЦР, проводя его многократно без ущерба для точности воспроизведения ДНК-последовательностей. И так бы оно продолжалось, если бы не Хуимин Конг из биотехнологической компании в штате Массачусетс (США). Он придумал использовать в ПЦР совершенно иной фермент, а именно геликазу, который расплетает в ядре спирально, или «геликально», свернутые цепи ДНК.

Фермент геликаза известен с 1970-х гг., но лишь относительно недавно были выделены гены различных геликаз и получен белок в чистом виде. Суть нового метода заключается в легком нагревании среды до температуры  37 °С, при которой фермент «разводит» цепи, а специально добавленный так называемый связывающий протеин не дает цепям «сцепиться» вновь.

Далее добавляются затравки, и геликаза ведет процесс до логического конца. Многократное повторение циклов дает необходимое количество копий ДНК. Конгу уже удалось получить большое число копий микробной ДНК из образца крови пациента. Чтобы понизить температуру протекания реакции до комнатной, Конг предлагает поискать геликазы холодолюбивых микробов.

На сегодня известны уже сотни генов природных геликаз, так что что-нибудь подходящее обязательно найдется. Ведь мир так разнообразен, что для решения одних и тех же задач природа создает самые разные возможности. В том числе она разнообразит мозг, в котором рождаются необыкновенные идеи...

Материал подготовил И.Э.ЛАЛАЯНЦ
(New Scientist, 2004, № 2456, р. 13)