Установление третичной
структуры белка и конфигураций
гемоглобина и миоглобина

Еще в 1937 г. М.Перутц начал изучать строение молекулы гемоглобина. Позже к нему присоединился Дж.Кендрю, сосредоточивший свое внимание на структуре молекулы миоглобина. Длительное время ученые неустанно исследовали эти вещества, играющие исключительную роль в энергетике окислительных процессов. В результате в 1957 г. Кендрю впервые смог «реально увидеть» структуру белка в системе трех координат. Трехмерные структуры миоглобина (Кендрю) и гемоглобина (Перутц) окончательно были определены в 1959 г. при использовании для обработки результатов рентгеноструктурного анализа математических расчетов на ЭВМ. В 1962 г. Перутц и Кендрю были удостоены Нобелевской премии по химии за выдающиеся открытия в области дифракции рентгеновских лучей кристаллами гемоглобина, химотрипсина и миоглобина.

Дыхательные ферменты:
гемоглобин и миоглобин

Два белка – гемоглобин¹  и миоглобин – часто называют дыхательными ферментами (рис. 1). Оба этих вещества выполняют роль переносчиков при дыхании: гемоглобин – основной компонент красных кровяных телец²  (эритроцитов), переносящих по артериям кислород из легких к тканям; миоглобин – красный белок в мышцах, принимающий кислород от гемоглобина и хранящий его там до того момента, когда он потребуется для окисления пищевых веществ. Эти процессы в организме сопряжены с одновременным переносом углекислого газа, переправляемого из тканей в легкие, в основном в виде бикарбоната. Перенос бикарбоната и углекислого газа идет также при содействии гемоглобина.

Миоглобин и гемоглобин представляют собой белки, соединенные с железосодержащим пигментом – гемом³  (рис. 2). Белковая часть миоглобина содержит около 2500 атомов углерода, азота, кислорода, водорода и серы, соединенных друг с другом в длинную цепь, образующую своего рода корзинку вокруг группы гема. Все 2500 атомов молекулы миоглобина подчинены единственному атому железа, расположенному в центре гема, они обеспечивают обратимое взаимодействие железа с молекулами кислорода.

Было установлено, что гем приобретает способность переносить кислород лишь при условии, если его окружает и защищает специфический белок – глобин (сам по себе гем не связывает кислород). Обычно при соединении кислорода с железом один или более электронов необратимо переходят с атомов железа на атомы кислорода. Иными словами, происходит химическая реакция. Экспериментально было доказано, что миоглобин и гемоглобин обладают уникальной способностью обратимо связывать O₂ без окисления гемового Fe²⁺ в Fe³⁺. Таким образом, процесс дыхания, который на первый взгляд кажется столь простым, на самом деле осуществляется благодаря взаимодействию многих видов атомов в гигантских молекулах чрезвычайной сложности.
Проблемой молекулярного механизма дыхания, а в связи с этим выяснением строения гемоглобина и миоглобина на протяжении долгого времени занимались английские ученые М.Перутц и Дж.Кендрю. Взаимодействие указанных соединений с субстратом – кислородом – было детально выяснено прежде всего на основе рентгеноструктурного анализа высокого разрешения.

Применение Перутцем
метода тяжелых атомов
для изучения гемоглобина

Изучение структуры белков методом рентгеноструктурного анализа началось в конце 1930-х гг., когда Дж.Бернал, Д.Кроуфут-Ходжкин, Д.Филлипс и другие стали получать первые рентгенограммы белковых кристаллов. В то время метод рентгеноструктурного анализа применялся в основном для изучения структуры простых молекул. Белковые молекулы были настолько сложными, что в течение последующих 15 лет ученым так и не удалось добиться существенных успехов при изучении их структуры. Однако сам метод за это время значительно усовершенствовался с технической стороны.
Стремительный прогресс в области рентгеноструктурного анализа начался в 1953 г. с разработки Перутцем метода изоморфного замещения (введение атомов тяжелых металлов в молекулы кристаллических белков). Этот прием позволил использовать рентгеноструктурный анализ для исследования белка гемоглобина.
Суть метода заключается в том, что молекулу вещества несколько видоизменяют путем введения в нее тяжелых атомов. Сделать это надо так, чтобы пространственная структура белка существенно не исказилась, например, путем присоединения атомов ртути или серебра к свободным сульфгидрильным группам (–SO₃H) белка. Присутствие тяжелого атома вызывает заметные изменения в дифракционной картине рентгеновских лучей. По разнице амплитуд волн, соответствующих отражению белка с тяжелым атомом и без него, для каждой группы волн можно было определить расстояние от гребня волны до тяжелого атома для каждой интерференционной полосы. Благодаря тяжелому атому, определяющему общую начальную точку отсчета, появилась возможность измерить величину фазы. (Об основах рентгенографического анализа и фазовой проблеме подробнее см. статью «Прямые методы в рентгеновской кристаллографии». «Химия», 2003, № 4.) Решив наконец-то фазовую проблему, можно было попробовать построить структурное изображение молекулы гемоглобина, но уже на основе новых рентгенографических данных.

Изучение молекул
миоглобина и гемоглобина –
установление третичной структуры⁴ 

Пока Перутц разбирался с молекулой гемоглобина, Кендрю успешно применил его метод тяжелых атомов для изучения структуры сравнительно простого белка миоглобина кашалота.
В ранних работах по изучению структуры гемоглобина Перутц получал проекции молекул на плоскости. Однако, как писал впоследствии Кендрю [1], анализ таких изображений, являвшихся по существу лишь силуэтами очень сложных молекул, давал мало сведений об их структуре. Было очевидно, что при дальнейшем использовании метода необходимо ввести в него такие усовершенствования, которые бы позволяли исследовать структуры в системе трех координат.
В результате работы с миоглобином при использовании метода изоморфного замещения⁵   Кендрю в 1957 г. на основе рентгеноструктурного анализа впервые получил трехмерную модель этой молекулы с разрешением до 6 ⁶ . Хотя такое разрешение было недостаточным для выявления боковых цепей и даже конфигурации самой полипептидной цепи, оно давало картину общего расположения полипептидной цепи и группы гема, другими словами, позволяло определить в общем виде третичную структуру молекулы. Как вспоминал позднее Кендрю, «мы увидели нечто, чего никто ранее не увидел... Это была трехмерная структура молекулы белка во всей ее сложности» [2].
При условии различения объектов на расстоянии 6 ученый смог установить спиральный рисунок полипептидной цепи миоглобина. Неожиданно оказалось, что эта третичная структура отличается значительной неправильностью и большой сложностью. Как заключил Кендрю, «стало очевидно, что простой геометрический порядок, наличие которого предполагалось многими ранними теориями строения белковой молекулы, в действительности не существует» [см. 1] (рис. 3).

Ученому удалось не только проследить пептидную цепь, но и локализовать положение гема на карте электронной плотности (рис. 4).

Указанные выше особенности структуры еще больше прояснились в 1959 г., когда Кендрю получил изображение молекулы миоглобина при разрешающей способности в 2 . Это достижение стало возможным благодаря использованию мощных компьютеров, необходимых для проведения математических подсчетов.
Ученый писал: «Хотя в этом случае соседние ковалентно связанные атомы отчетливо не различаются, однако можно было различать атомы, связанные водородными или вандерваальсовыми силами притяжения, что дало нам возможность сделать определенные выводы о взаимном расположении атомов в молекулах» [см. 1].
Веским доказательством надежности метода являлось хорошее совпадение ожидаемого теоретически и обнаруженного экспериментально расположения группы гема с содержащимся в ее центре атомом железа (см. рис. 4). Можно было видеть, что атом железа присоединен к соседней полипептидной цепи посредством имидазольного кольца, являющегося остатком гистидина. «Большая часть полипептидных цепей состояла из целого ряда отрезков правозакрученных
-спиралей», параметры которых близко совпадали с параметрами, указанными Л.Полингом и К.Кори. Таким образом, удалось впервые «увидеть» -спираль в молекуле белка. Ученый показал, что 70% цепи находится в подобной спиральной конформации, впоследствии это было подтверждено методом дейтерообмена.
Исследованиями Кендрю было окончательно установлено, что молекула миоглобина имеет компактную форму – 4,5x3,5x2,5 нм (рис. 5), а полипептидная цепь образует 8 спирализованных участков, обозначаемых буквами от А до Н. Она специфическим образом уложена вокруг большого плоского железосодержащего кольца гема.

Рис. 5. Модель структуры миоглобина (окончательный вариант)

Применив для обработки результатов анализа ЭВМ, в 1959 г. ученый расшифровал пространственное строение молекулы миоглобина. Он построил также модель, дающую представление о положении большинства из 2500 атомов этой молекулы.
Между тем, продолжая свои исследования, Перутц с сотрудниками получил также трехмерное изображение молекулы гемоглобина лошади с разрешением до 5,5 . Расшифровка структуры этой более крупной белковой молекулы была значительно облегчена результатами, полученными при изучении третичной структуры миоглобина кашалота. Оказалось, что структура миоглобина чрезвычайно близка к третичной структуре каждой из четырех субъединиц гемоглобина. Вот как об этом вспоминал сам Перутц: «Летом 1959 года, почти через 22 года после того, как я получил первую рентгенограмму гемоглобина, мы смогли наконец построить трехмерную карту электронной плотности гемоглобина с разрешающей способностью 5,5 ангстрем, подобную той, которая на два года раньше была получена для миоглобина. И как только цифры со счетчика были перенесены на контурную карту, мы убедились в том, что каждая из четырех цепей гемоглобина по форме очень напоминает единственную цепь миоглобина. Бета-цепь и миоглобин были вообще идентичны, а альфа-цепь отличалась от них лишь более коротким поперечником одной маленькой петли. Миоглобин был экстрагирован Кендрю из мышц кашалота. Гемоглобин был получен из крови лошадей. Позднейшие исследования показали, что миоглобин тюленя и лошади, гемоглобин человека и коровы имеют также сходное строение» [3].
Четвертичная структура гемоглобина достаточно проста: она образована из четырех миоглобиноподобных субъединиц (двух - и двух -субъединиц), т.е. полипептидных цепей, упакованных в виде тетраэдра (64x55x50 ). На рис. 6 показано, как эти четыре субъединицы объединены в четвертичную структуру.

Все четыре группы гема расположены как бы в отдельных пазухах сфероида. Как заметил Перутц, «на первый взгляд случайная беспорядочная складчатость цепи оказалась целесообразной, удобной для удержания гема в положении, облегчающем ему перенос кислорода» [см. 3]. Ведь, как известно, каждый гем несет атом железа, способный соединяться с одной молекулой кислорода. Что интересно, по ходу этой реакции происходит перегруппировка всех четырех субъединиц, структура становится более компактной. В частности, атомы железа -цепей сближаются (по данным Перутца, расстояние между ними уменьшается на 7 ), и субъединицы поворачиваются друг относительно друга. Таким образом, гемоглобин при соединении с кислородом достаточно сильно меняет структуру, несмотря на то, что составляющие его субъединицы очень схожи с миоглобином, который при связывании кислорода не претерпевает никаких структурных изменений. Перутц показал, что указанные структурные изменения влияют на повышение сродства группы гема гемоглобина к кислороду. Применив для обработки результатов анализа ЭВМ, Перутцу удалось в том же году расшифровать и построить модель молекулы гемоглобина, дающую представление о положении почти каждого ее атома (порядка 10 тыс.).
О том, насколько была сложна и трудна работа, проведенная Перутцем, можно судить по высказыванию У.Л.Брэгга, который прокомментировал ее следующими фактами. Лишь при изучении кристаллического гемоглобина лошади исследователям пришлось замерить 28 тыс. рефлексов, а при их обработке для построения полного трехмерного паттерсоновского синтеза число слагаемых во всех трех суммах составило 1,21 ^. 10¹⁰. Несмотря на большое количество вспомогательных вычислительных и механических усовершенствований, сокращающих эту работу, измерение 28 тыс. рефлексов и вычисление всех тройных сумм для одного кристалла гемоглобина потребовали целых четыре года. Как заметил Брэгг, «когда эта работа планировалась, не было никаких гарантий, что ее результаты оправдают вложенные усилия, но, к счастью, эти опасения не оправдались» [см. 3].

¹ Гемоглобин открыл немецкий физиолог К.Б.Рейхарт в 1847 г. в Дерптском университете (соответствующая работа была опубликована несколько позднее, в 1849 г.), наблюдая его кристаллы у морской свинки.
² Один эритроцит содержит 280 млн молекул гемоглобина.
³ Гем – это комплекс порфирина с двухвалентным железом.
⁴ Как известно, в 1952 г. К.У.Линдерстрём-Ланг дал трехуровневую классификацию структуры белков. Первичная структура – последовательность аминокислот, вторичная структура – конформация и третичная структура – характер расположения отдельных участков цепи, дающий пространственную картину, присущую глобулярным белкам. Позднее было показано, что основную роль в поддержании третичной структуры играют дисульфидные связи. Термин «четвертичная структура» был предложен в 1958 г. английским кристаллографом Дж.Берналом как необходимое дополнение к этой классификации.
⁵ Кендрю было проведено сравнение дифракционных картин кристаллического миоглобина
с n-хлормеркурбензолсульфокислотой или ртутьдиаммином, а также с обоими реагентами.
⁶ Ангстрем – единица длины, равная одной стомиллионной доле сантиметра. Близко расположенные атомы, связанные химически, обычно отстоят друг от друга на 1–2 .

* * *

ПЕРУТЦ Макс Фердинанд (19.V.1914–06.II.2002), английский биохимик, родился в Вене. Его родители Хуго Перутц и Дели Гольдшмит были текстильными фабрикантами. Предполагалось, что сын пойдет по стопам родителей. Но один из педагогов гимназии пробудил в мальчике большой интерес к химии, чему родители не стали препятствовать и поддержали его при поступлении в университет. В 1932 г. Перутц поступил в Венский университет, где стал специализироваться в области биохимии.
Во время учебы его внимание привлекли работы знаменитого английского исследователя Дж.Гопкинса – создателя современной витаминологии. Юноша мечтал поехать к нему на стажировку. Случилось так, что один из преподавателей университета как раз направлялся в командировку в Англию, и Перутц попросил его походатайствовать в лаборатории Гопкинса о свободной вакансии. Но тот, приехав в Кембридж, вдруг неожиданно попал в лабораторию известного физика Джона Д.Бернала и был просто очарован рентгенограммами кристаллов и тем направлением работ, которое развивалось в то время в лаборатории ученого. Бернал нуждался в молодом сотруднике для рентгено-кристаллографических исследований, и преподаватель порекомендовал ему Перутца. Получив согласие маститого ученого, он сразу сообщил об этой возможности юноше. Первой реакцией Перутца на это предложение было недоумение: «Ведь я же не умею снимать рентгенограммы!» «Ничего, мой друг, научишься», – ответствовал ему преподаватель. Так неожиданным образом определилось дальнейшее направление работ молодого исследователя.
Родители со своей стороны опять материально поддержали сына, и в 1936 г. Перутц смог поехать в лабораторию Бернала. Здесь он научился получать вполне приличные рентгеновские снимки кристаллов, но собственной темы для исследований долгое время не находил.
В 1937 г. во время летних каникул, находясь в Австрии, Перутц неожиданно вспомнил, что его кузина в Праге замужем за крупным биохимиком Ф.Гурвицем, известным своими работами о механизме связывания кислорода гемоглобином. Перутц решил посоветоваться со своим родственником относительно направления работы. Гурвиц порекомендовал в качестве темы для диссертации изучение структуры различных форм гемоглобина, чем молодой ученый и занялся по возвращении в Англию.
В марте 1938 г. Гитлер вторгся в Австрию, предприятия родителей были экспроприированы, они сами едва успели бежать в Швейцарию. Обратный путь в Австрию для всей семьи был закрыт. На плечи Перутца легли новые для него материальные заботы о семье. К счастью, ему удалось к этому времени опубликовать несколько сообщений по теме диссертации, которые получили одобрение научного сообщества. В результате он получил небольшой грант на продолжение исследований.
В это время Бернал покинул Кембридж, но Перутц приобрел нового покровителя в лице У.Л.Брэгга, приступившего незадолго до этого к работе в Кембриджском университете. Именно по его ходатайству Перутцу удалось получить субсидию престижного Рокфеллеровского фонда под свою тему работы. Благодаря ей ученый остался в университете в качестве ассистента-исследователя Брэгга и к 1940 г. смог завершить диссертацию, получив искомую докторскую степень. Укрепление материального положения позволило ему наконец-то забрать родителей-изгнанников из Швейцарии в Англию.
Но с вовлечением в войну Англии Перутц, не имевший британского гражданства, неожиданно был интернирован (как подданный враждебного государства) и отправлен военным судном в Канаду, где был размещен в специальном лагере. Однако через некоторое время, по ходатайству своего научного руководителя, он смог вновь вернуться в Кембридж.
После войны Перутц получил стипендию от «Империал кемикл индастриз» на проведение исследований и вернулся к изучению гемоглобина в Кавендишской лаборатории. Когда через два года срок выплаты стипендии окончился, его назначили руководителем группы молекулярной биологии в Кембриджском университете (1947). Там он познакомился с Джоном К.Кендрю, который тогда готовил докторскую диссертацию и занимался исследованием путем рентгеновского излучения миоглобина – вещества, запасающего кислород в мышцах животных и человека. С течением времени штат группы молекулярной биологии несколько увеличился. Перутц и его коллеги более интенсивно занялись поисками упорядоченности в структуре белковых молекул. Если бы они смогли установить, что такая упорядоченность действительно существует, стало бы возможным расшифровать структуру кристаллического белка методом проб и ошибок, построив его модель.
Научным прорывом в этом направлении явился разработанный Перутцем метод изоморфного замещения. К 1956 г. ученый получил полдюжины видов молекул гемоглобина, в каждой из которых атом тяжелого металла находился в разных местах. За четыре последующих года ученый собрал тысячи фотографических пластинок и обработал полученные на них результаты с помощью компьютера. В результате в 1959 г. им была предложена модель трехмерной структуры гемоглобина. Результаты исследований были опубликованы в феврале следующего года в английском журнале «Nature» («Природа») [4] вместе с открытиями Кендрю [5], которые касались молекулы миоглобина.
В 1942 г. Перутц женился на Гизеле Кларе Пейзер, которая работала фотографом медицинской службы. У супругов родились сын и дочь.
С 1954 г. ученый состоял членом Лондонского королевского общества, в 1963–1969 гг. возглавлял Европейскую организацию молекулярной биологии, а в 1974–1979 гг. он являлся профессором физиологии Королевского института в Лондоне.
В 1962 г. ученый после получения Нобелевской премии возглавил лабораторию молекулярной биологии (бывшую группу молекулярной биологии Кембриджского университета). На этом посту он находился до 1979 г., который затем добровольно покинул, но по-прежнему продолжал свои исследования гемоглобина.
Перутц награжден Королевской медалью (1971) и медалью Копли (1979) Лондонского королевского общества. Ученый являлся иностранным членом Французской академии наук и американской Национальной академии наук. Ему были присуждены почетные степени университетов Эдинбурга, Нориджа, Зальцбурга и Вены.

* * *

КЕНДРЮ Джон Коудери (24.III.1917–23.VIII.1997), английский биохимик, родился в Оксфорде. Он был единственным сыном Уилфрида Джорджа Кендрю, известного климатолога, который преподавал в Оксфордском университете, и Эвелин Мэй Грэм (Сэндберг) Кендрю, историка искусств, которая занималась итальянскими художниками-примитивистами и опубликовала ряд работ на эту тему. Первоначальное образование мальчик получил в Дрэгон-скул в Оксфорде, а затем в Клифтон-колледже в Бристоле. Ко времени окончания Клифтон-колледжа Кендрю уже опредилился в своих карьерных предпочтениях. Он решил стать ученым и для получения соответствующего высшего образования поступил в Кембриджский университет. В 1939 г. он окончил Тринити-колледж в Кембридже и получил степень бакалавра наук по химии. В 1943 г. Кендрю получил диплом магистра.
Через год после того, как в 1939 г. Великобритания объявила, что находится в состоянии войны с Германией, Кендрю поступил на службу в Министерство промышленной авиации в качестве младшего офицера и научного сотрудника. Все военные годы он состоял при Королевском воздушном флоте. В 1944 г. Кендрю был назначен научным советником главнокомандующего военно-воздушных сил союзников, базирующихся в Юго-Восточной Азии. Ближе к концу второй мировой войны, после знакомства с английским химиком Дж.Д.Берналом и американским химиком Л.К.Полингом, Кендрю решил отказаться от военной карьеры. Он заинтересовался в то время проблемой строения молекулярных белков. Поэтому, оставив военную службу, он вновь возвратился в 1946 г. в Кембридж и стал работать вместе с Перутцем в Кавендишской лаборатории.
В 1947 г. Кендрю вслед за Перутцем перешел работать в группу молекулярной биологии, созданную в том же году при Кавендишской лаборатории Медицинским научно-исследовательским советом. Сначала ученые состояли в ее штате лишь вдвоем, но со временем к ним присоединились Ф.Крик, Дж.Д.Уотсон, Ф.Сенгер и другие ученые.
Работа в Кавендишской лаборатории дала свои первые результаты достаточно быстро: уже в 1949 г. молодой ученый получил степень доктора философии по физике.
С 1953 по 1974 г. Кендрю являлся заместителем заведующего лаборатории молекулярной биологии в Кембридже. В 1962 г. он получил степень доктора наук и в том же году вместе с М.Перутцем стал лауреатом Нобелевской премии. В 1963 г. ученый был посвящен в пэры. В 1975 г. Кендрю был назначен первым директором Европейской лаборатории молекулярной биологии в Гейдельберге (Германия). Этот пост он занимал до 1982 г. В 1981 г. ученый был избран президентом колледжа св. Иоанна Оксфордского университета.
Помимо Нобелевской премии Кендрю был награжден Королевской медалью Лондонского королевского общества (1965). Ученый являлся основателем и главным редактором широко известного в научном мире периодического издания «Journal of Molecular Biology» («Журнал молекулярной биологии»). В течение многих лет он состоял членом Британской ассоциации содействия развитию науки, почетным секретарем Британского биофизического общества, а с 1974 по 1979 г. он также попечитель Британского музея. Ученый был избран почетным членом Американской академии наук и искусств, Германской академии естествоиспытателей «Леопольдина», Гейдельбергской академии наук, Болгарской академии наук и Ирландской королевской академии наук. Кендрю состоял членом Лондонского королевского общества, являлся обладателем почетных степеней университетов Киля, Ридинга, Бэкингема и Эксетера.

ЛИТЕРАТУРА

1. Кендрю Дж.К. Структура глобулярных белков. Труды V Международного биохимического конгресса «Биологические структуры и функции на молекулярном уровне». Симпозиум I. М.: Изд-во АН СССР, 1962, с. 7–13.
2. Лауреаты Нобелевской премии. Энциклопедия. Пер. с англ. М.: Прогресс, 1992.
3. Перутц М. Молекулярный механизм дыхания. Наука и человечество. М.: Знание, 1966, с. 50–59, с. 85–86.
4. Perutz M.F., Rossmann M.G., Cullis A.F., Muirhead H., Will G. A.C.T. North Structure of hemoglobin. A three-dimensional Fourier synthesis at 5,5 resolution, obtained by X-ray analysis. Nature, 1960, v. 185, 13 February, p. 416–421.
5. Kendrew J.C., Dickerson R.E., Strandberg B.E., Hart R.G., Davies D.R., Phillips D.C., Shore V.C. Structure of myoglobin. A three-dimensional Fourier synthesis at 2 resolution. Nature, 1960, v. 185, 13 February, p. 422–427.

Е.А.ЗАЙЦЕВА