Летопись важнейших открытий

Установление цикличности
процесса усвоения СО₂
растениями при фотосинтезе

В 1961 г. М.Кэлвину была присуждена Нобелевская премия по химии «за исследование усвоения двуокиси углерода растениями». В общей сложности исследования в этом направлении ученым проводились порядка 20 лет, начиная с 1946 г. К 1956 г. им была окончательно сформирована циклическая схема процесса фотоассимиляции СО₂ при фотосинтезе, выяснена природа акцептора и первого промежуточного продукта в этом процессе.
История открытия фотосинтеза – процесса, благодаря которому зеленое растение за счет энергии солнечного света создает из неорганических соединений – углекислого газа и воды – органические соединения, – насчитывает более 200 лет.

К истории проблемы фотосинтеза

Уже во времена античности рядом натурфилософов высказывались мысли, что растения получают пищу из почвы. Наиболее четко эти представления были сформулированы в трудах Аристотеля (IV в. до н. э.) и практически без ревизии просуществовали до начала XVII в., пока в 1600–1605 гг. голландский естествоиспытатель Я. ван Гельмонт не поставил свой знаменитый опыт с выращиванием ивы. Он высказал идею о том, что все питательные вещества растения получают из воды.
В начале XVIII в. английский химик С.Гейлс и несколько позже российский ученый М.В.Ломоносов предположили, что растения получают питательные вещества из воздуха.
В 1771 г. английский химик Дж.Пристли поставил свой классический эксперимент: в замкнутом пространстве, где горит свеча, «портится воздух», а растение его «очищает». Ему впервые удалось обнаружить, что на свету растения выделяют кислород. Именно опыт Пристли ознаменовал собой начало экспериментальных исследований фотосинтеза.
Вскоре прямыми экспериментами нидерландского врача Я.Ингенхауза было показано, что растение выделяет кислород при освещении, а в темноте его поглощает. Швейцарский естествоиспытатель Ж.Сенебье, известный как один из первых исследователей фотохимического действия света, установил, что при этом растение поглощает углекислоту (распространенное название диоксида углерода) и выделяет кислород. Почти через 50 лет после опытов Пристли наконец-то было выделено зеленое начало растений – хлорофилл¹ (французскими химиками П.Ж.Пельтье и Ж.Б.Каванту, 1818 г.).
Большой вклад в выяснение механизма использования растением солнечной энергии и роли в этом процессе пигмента хлорофилла был внесен русским ученым К.А.Тимирязевым во второй половине XIX в. Тимирязев распространил закон сохранения энергии на органический мир – на растение, показав соответствие между поглощением света и производимой им химической работы. Он первым связал фотосинтез с фотосенсибилизацией², когда свет, поглощенный окрашенным хлорофиллом, используется для превращения неокрашенных воды и углекислоты.
Уже к 1870-м гг. было установлено, что основными веществами, образующимися в процессе фотосинтеза, являются углеводы (сахара и преимущественно крахмал). Но о путях их синтеза было известно очень мало. Дело в том, что эти процессы в растительном организме происходят очень быстро и промежуточные продукты плохо уловимы. Предположение известного немецкого ученого Ю.Либиха о том, что в синтезе углеводов участвует ряд органических кислот, сменила гипотеза А.Байера, имевшая долгое время широкое распространение, согласно которой углекислота на первом этапе фотосинтеза восстанавливается до формальдегида, который и превращается в сахара. Это соответствовало стехиометрии взаимодействия воды и углекислоты с выделением кислорода:

СО₂ + Н₂О = HCOH + O₂.

Подобные взгляды излагались в учебниках практически до начала 1940-х гг., пока применение углекислоты, меченной изотопами углерода, не внесло ясность в эту проблему.
Следует заметить, что важным этапом в развитии взглядов на процесс ассимиляции углекислоты и фотосинтез в целом являлись работы американского ученого Ван-Ниля, проведенные на фототрофных бактериях³ (1930-е гг.). Из полученных им данных следовало, что фотосинтез является окислительно-восстановительным процессом, при котором углекислота восстанавливается за счет водорода воды и, возможно, других субстратов. Таким образом, приведенное выше как основное уравнение процесса фотосинтеза отражает лишь его частный случай. В более общем виде применительно к фототрофным растениям и бактериям, фиксирующим углекислоту, этот процесс должен быть выражен другим уравнением:

СО₂ + 2Н₂А + свет = (HCOH) + Н₂О + 2А,

где Н₂А – донор водорода (электрона), (HCOH) – символ образуемых органических веществ.
Несколько позднее ученые Г.Фоглер и Т.Умбрайт показали, что ассимиляция углекислоты бактериями Thiobacillus thiooxidans связана с метаболизмом фосфора. Авторы высказали предположение, что важную роль в этом случае при усвоении углекислоты играет АТФ (аденозинтрифосфорная кислота). Эту точку зрения другие исследователи попытались распространить и на фотоассимиляцию растениями СО_2, но принята она была не сразу.
Указанные работы в значительной степени стали тем фундаментом, на котором смог позднее создать свою теорию усвоения углекислого газа в процессе фотосинтеза Кэлвин с сотрудниками.

Применение метода меченых атомов
для выяснения путей усвоения
углекислоты в фотосинтезе

Первые работы, относящиеся к изучению процесса фотосинтеза с меченым углеродом, относятся к концу 1930-х гг. В них использовался изотоп углерода ¹¹С с периодом полураспада всего 22 мин. Американские исследователи высказали предположение, что углекислота фиксируется в карбоксильной группе некоторого органического соединения, природа которого не была установлена. Во время второй мировой войны эти исследования были прекращены.
В послевоенные годы исследователям стал широко доступен более долгоживущий изотоп углерода – ¹⁴С, который в 1946 г. начал целенаправленно использовать в своих работах по изучению механизма фотосинтеза Кэлвин с сотрудниками.
Эксперимент состоял в следующем. Кэлвин помещал диоксид углерода, содержащий ¹⁴С, в круглый сосуд из тонкого стекла, наполненный морскими водорослями Chlorella pirenoidosa. Сосуд освещался, поэтому водоросли и меченые атомы диоксида углерода, свободно взаимодействуя, образовывали соединения, участвующие в фотосинтезе. В начале работы были большие надежды на то, что применение меченого углерода быстро приведет к выяснению механизма восстановления диоксида углерода. Но при первых же экспериментах стало ясно, что, каковы бы ни были промежуточные и первичные продукты превращения СО₂ в процессе фотосинтеза, они очень быстро трансформируются в большое количество других соединений. Кроме того, меченый углерод, включившийся в первичные продукты, перераспределяется среди множества других метаболитов, и через несколько минут ¹⁴С появляется в соединениях различного типа, включая сахара, белки и даже жиры. В результате исследователи наблюдали сложную смесь радиоактивно помеченных органических соединений.
Для идентификации соединений с мечеными атомами применялся метод бумажной хроматографии, основанный на разделении компонентов смеси благодаря их различному перемещению растворителями вдоль полоски фильтровальной бумаги. Каждый компонент образует пятно на соответствующем месте этой полоски, которое затем можно сравнить с распределением пятен, оставленных известными химическими реагентами. Чтобы установить пятна, содержащие меченые атомы углерода, одновременно использовали рентгеновскую пленку, которая темнеет в присутствии любого радиоактивного излучения (ее накладывали на полоски фильтровальной бумаги).
«К сожалению, на этой бумаге, как правило, не отпечатываются названия соединений, – впоследствии вспоминал Кэлвин, – и наша первоначальная утомительная работа в течение 10 лет заключалась в том, чтобы тщательно метить эти потемневшие места на пленке».
Различное время экспозиции растения с меченым СО₂ (начиная с секунды) позволило установить некоторую последовательность превращений углекислого газа, усвоенного растением. В частности, Кэлвин обнаружил, что даже после короткого воздействия (менее одной секунды) на меченый диоксид углерода в качестве преобладающего продукта превращений является 3-фосфоглицериновая кислота. Это говорило о том, что первой ступенью реакции была «конденсация» СО₂ с каким-то промежуточным органическим соединением, в результате которой образовывалась именно эта кислота. А поскольку последняя содержала три атома углерода, то естественно было предположить, что акцептор диоксида углерода содержит два атома углерода. Именно поэтому в течение ряда лет ученый пытался безуспешно «выловить» этот двухуглеродный акцептор.
В работе ученому активно помогали Э.А.Бенсон, только что защитивший под руководством Кэлвина диссертацию, и Дж.А.Бэссхем, студент. Исследователи методично продолжали изучать отдельные этапы превращений углекислоты и роль участвующих ферментативных систем. На основе экспериментальных данных и под сильным влиянием аналогий с другими, лучше изученными обменными процессами были предложены первые циклические схемы фотосинтеза. Так, в частности, Кэлвин и Бенсон предположили, что диоксид углерода и донор водорода должны вовлекаться в цикл подобный, но противоположный по направлению известному катаболическому циклу дыхательного карбоксилирования и дегидрирования⁴, который получил известность как цикл трикарбоновых кислот, или цикл Кребса (рис. 1).

Рис. 1. Цикл Кребса

В результате уже в 1948 г. Кэлвин с сотрудниками полагал, что подобный циклический механизм⁵, действующий в «обратном направлении», – анаболический цикл⁶ должен происходить так, как показано на рис. 2.

Рис. 2. Катаболический цикл дыхания (а) и анаболический цикл фотосинтеза (б), согласно представлениям Кэлвина и Бенсона (1948)

Попадая в клетку, углекислый газ присоединяется сначала к акцептору и уже вместе с ним претерпевает превращения. Ученый предположил, что акцептор должен содержать фосфор, т. к., присоединяя углекислый газ, он дает молекулу фосфоглицериновой кислоты. Цикл может начинаться с одной молекулы фосфоглицериновой кислоты и заканчиваться двумя такими молекулами, после того как вторая молекула будет синтезирована из диоксида углерода (при участии одной или нескольких карбоксилаз) и из водородных атомов, взятых от воды (через серию неизвестных реакций, из которых по меньшей мере одна должна быть фотохимической). Из двух молекул фосфоглицериновой кислоты, имеющихся в конце цикла, одна может восстанавливаться до триозы и затем димеризоваться до гексозы, тогда как другая может возвратиться в цикл.
К началу 1950-х гг. Кэлвину и его команде стало ясно, что использование классических методов выделения и определения большого количества радиоактивных органических веществ, которые они обнаруживали в процессе фотосинтеза, – очень трудоемкая работа и требует много времени для идентификации некоторых из этих веществ. Их многолетние опыты в очередной раз подтверждали, что на ранней стадии процесс восстановления диоксида углерода при фотосинтезе может разветвляться на различные побочные реакции (включая стадии, приводящие к образованию простых аминокислот, а возможно, затем и белков) до того, как будет достигнута стадия восстановления углеводов. Многие кислоты, обнаруженные ими ранее как промежуточные участники «обратной схемы» цикла трикарбоновых кислот, подвергались сомнению (в частности, щавелевоуксусная, янтарная и проч.). Такой большой массив получаемой в экспериментах информации было крайне трудно с достоверностью обработать.
Необходимость создания новой быстрой аналитической методики привела Кэлвина к разработке метода двухмерных хроматографических карт для промежуточных продуктов фотосинтеза. Благодаря новой методике стал возможным уже детальный кинетический анализ включения ¹⁴СО₂ в различные метаболические промежуточные продукты. В результате среди продуктов фотосинтеза им неожиданно были обнаружены седогептулезо- и рибулезофосфаты (сахара с 5 и 7 атомами углерода в цепи). Эти наблюдения указывали, что С₇- и С₅-соединения могут служить предшественниками искомого С₂-акцептора. На основе этих данных была предложена схема механизма восстановления СО₂ через сахара с 7 и 5 атомами углерода (рис. 3).

Рис. 3. Механизм восстановления СО2 с регенерацией С2-акцептора через сахара с 7 и 5 атомами углерода (схема Бенсона–Бэссхема– Кэлвина, 1951 г.): два карбоксилирования (С1 и С2) и четыре восстановления (R1, R2, R3, R4)

Расширение спектра обнаруженных промежуточных продуктов фотосинтеза (фруктозо-6-фосфат, глюкозо-6-фосфат, тиаминпирофосфат (ТПФ) и др.) привело Кэлвина к осознанию того факта, что искомым акцептором является в конечном счете углевод рибулезо-1,5-дифосфат (С₅-соединение) , две молекулы фосфоглицериновой кислоты (а не одну, как считалось раньше). Так был открыт пентозофосфатный восстановительный цикл углерода (рис. 4), получивший название в научной литературе как цикл Бенсона–Бэссхема–Кэлвина, или цикл Кэлвина. В результате другие предполагаемые реакции быстро обрели свое место на этой схеме.

Рис. 4. Пентозофосфатный восстановительный цикл углерода – цикл Кэлвина: ТПФ – тиаминпирофосфат; АТФ – аденозинтрифосфат; НАДФ – никотинамидадениндинуклеотидфосфат

Итак, попадая в клетку, углекислый газ присоединяется сначала к акцептору и уже вместе с ним претерпевает превращения. Акцептор, содержащий фосфор, – это углевод рибулезо-1,5-дифосфат. Присоединяя углекислый газ, он дает две молекулы фосфоглицериновой кислоты. Последняя, восстанавливаясь за счет световой энергии, поглощенной растением, образует глицеральдегидфосфат (фосфоглицериновый альдегид) и частично диоксиацетонфосфат (фосфодиоксиацетон). В то же время часть синтезированных соединений подвергается ряду сложных ферментативных превращений (образуются разнообразные сахара, полисахариды и проч.). Одновременно вновь синтезируется рибулезо-1,5-дифосфат, который снова может присоединять углекислый газ. Стадии превращения диоксида углерода в углеводы, названные циклом Кэлвина, осуществляются в хлоропластах (внутриклеточные структуры растительной клетки, в которых осуществляется фотосинтез).
По мнению Кэлвина, фосфоглицериновая кислота представляет собой первый универсальный промежуточный продукт усвоения углекислого газа в фотосинтезе, из которого затем образуются разнообразные вещества углеводного характера (в частности, фруктозо-6-фосфат и глюкозо-6-фосфат).
Этот вывод Кэлвина был в дальнейшем подтвержден подавляющим большинством исследователей⁷.
Вскоре было окончательно установлено, что ассимиляция углекислоты при фотосинтезе является чисто темновым процессом и происходит за счет использования энергии аденозинтрифосфата (АТФ), а также за счет восстановленного никотинамидадениндинуклеотидфосфата (НАДФ), образующихся на первых этапах трансформации энергии света (см. рис. 4).
С помощью радиоактивных изотопов ученый в дальнейшем проследил также путь кислорода в реакциях фотосинтеза.
Присуждение Кэлвину в 1961 г. Нобелевской премии по химии – заслуженная награда ученому, способствовавшему своими трудами расшифровке важнейшего природного процесса. В своей нобелевской лекции Кэлвин подчеркнул, что его работа была выполнена на стыке наук (он определил эту область исследований как «химическая биодинамика») и именно данный подход к развитию научных исследований следует считать наиболее перспективным в ближайшие годы.

Литература

Современные проблемы фотосинтеза. Сборник статей. М.: Изд-во МГУ, 1973, 198 с.;
Calvin M. The Path of Carbon in Photosynthesis. Science, 1962, v. 135, p. 879–889;
Farber E. Nobel Prize Winners in Chemistry 1901–1961. London: Abelard-Schuman, 1963, p. 301–308;
Рабинович Е. Фотосинтез. М.: Изд-во ИЛ, 1959, т. 3.

* * *

Кэлвин МЕЛВИН(08.IV.1911–08.I.1997), американский химик-органик, родился в Сент-Поле (штат Миннесота, США) в семье Розы И. (Хервиц) Кэлвин и Элиаса Кэлвина. Его родители в свое время иммигрировали в США из России. Еще ребенком Кэлвин проявлял большую любознательность и любовь к учебе и к одиннадцатому классу решил стать химиком. Поскольку семья через некоторое время переехала в Детройт (штат Мичиган), то последние годы мальчик учился в местной средней школе. После окончания школы Кэлвин выиграл стипендию для обучения в Мичиганском колледже горного дела и технологии (ныне Мичиганский технологический университет). Здесь он в 1931 г. получил звание бакалавра естественных наук, а четыре года спустя за диссертацию на тему о сродстве к электрону йода и брома Миннесотский университет присудил ему докторскую степень по химии.
После защиты диссертации Кэлвин при поддержке фонда Рокфеллера поехал на стажировку в Манчестерский университет (Великобритания) в лабораторию профессора физической химии М.Поляни. Здесь молодой ученый изучал парамагнитную конверсию водорода и каталитическую активность металлопорфиринов – сложных органических молекул, содержащих атомы металла, производными которых являются гемоглобин и хлорофилл. Именно в этом университете у него появился интерес к изучению проблемы фотосинтеза.
В 1937 г. Кэлвин возвратился на родину и был назначен преподавателем химии Калифорнийского университета в Беркли, где занимался исследованиями электронной природы окрашенных органических соединений под руководством известного физикохимика Г.Н.Льюиса. В 1941 г. он уже получил звание адъюнкт-профессора.
Во время второй мировой войны Кэлвин с 1941 по 1944 г. работал в Научно-исследовательском совете национальной обороны. За этот период времени ученый разработал способ получения чистого кислорода из атмосферы, который успешно применялся в промышленном производстве, например, для проведения сварочных работ в тех местах, где обычно кислород недоступен. В 1944–1945 гг. ученый участвовал также в Манхэттенском проекте, связанном с разработкой методов очистки урана и плутония.
В 1945 г. Кэлвин возвратился в Беркли, два года спустя он получил звание полного профессора. С 1946 по 1980 г. ученый руководил отделением биоорганической химии в радиационной лаборатории Лоуренса (в 1960 г. переименована в лабораторию химической биодинамики). Именно в эти годы он вплотную занялся проблемами фотосинтеза.
Одновременно его научные исследования касались проблем сохранения и превращения солнечной энергии (создание новых видов источников топлива), происхождения жизни на Земле, а также химии мозга.
В 1960–1970-е гг. ученый также состоял штатным профессором молекулярной биологии, а затем химии в Калифорнийском университете.
Ученый принимал активное участие в работе многих национальных и международных комитетов, занимающихся проблемами мирного использования атомной энергии, биокосмонавтикой и др. Он также долгое время работал консультантом в Национальном управлении по аэронавтике и использованию космического пространства.
Кэлвин был женат на Мари-Женевьеве Жемтегаард, сотруднице патронажной организации. У супругов было трое детей: две дочери и сын.
Помимо Нобелевской премии (1961) Кэлвин был лауреатом премии по исследованию сахаров (1950), премии Американского химического общества (1955) и премии Гейлса Американского общества физиологов (1956); награжден медалями Флинтоффа (1955), Ричардса (1956) и Николса (1958) Американского химического общества, Дэви Лондонского Королевского общества (1964), Пристли Американского химического общества (1978), золотой медалью Американского института химиков (1978), премией Оуэспера Американского химического общества (1981), а также Национальной медалью в области естествознания (1989). Ученый состоял членом Лондонского Королевского общества, Нидерландской Академии наук, Американского философского общества, Американского физического общества, Американского общества физиологов (был его президентом в 1963–1964 гг.) и Американского химического общества (президент в 1971 г.).

¹Название происходит от греческого chloros – зеленый и phyllon – лист.
²Фотосенсибилизация – придание несветочувствительным веществам способности к фотохимическим превращениям. Фотосенсибилизация обусловлена присутствием светочувствительных примесей или специальных добавок, которые, переходя при облучении в возбужденное состояние, могут инициировать химические реакции. Применение этого термина (рассмотрение хлорофилла как фотосенсибилизатора реакции) основывалось на работах современника Тимирязева немецкого фотохимика Г.Фогеля.
³Фототрофные, или фотосинтезирующие, бактерии используют свет как источник энергии. В частности, при синтезе клеточных компонентов они используют световую энергию для получения водорода из неорганических или органических веществ.
⁴Цикл описывает механизм освобождения диоксида углерода при дыхании (так называемый катаболический цикл).
⁵Путь превращения углекислого газа в фотосинтезе носит циклический характер – первый и самый главный вывод ученого. Цикличность – важнейшее свойство процесса для биологической системы, т. к. только циклы могут быть саморегулируемыми. Аналогичным образом совершаются и другие процессы в растении: упоминавшееся дыхание, превращение белковых веществ, круговорот минеральных веществ и проч.
⁶Анаболизм – совокупность химических процессов в живом организме, направленных на образование и обновление структурных частей клеток и тканей. Составляет противоположную катаболизму сторону обмена веществ.
⁷Следует заметить, что уже в 1961 г. Кэлвин и Бэссхем сообщили о продуктах фотосинтеза неуглеводной природы. Это заключение было развито затем самим ученым и другими исследователями.

Е.А.ЗАЙЦЕВА