Химия в науке о жизни

Когда Джозеф Томсон (лауреат Нобелевской премии 1906 г. по физике) открыл в 1897 г. электрон – первую элементарную частицу, мало кто подозревал, что тем самым в естествознании была обозначена цель, неотъемлемая от таинственной проблемы квантования. Вскоре Нильс Бор разработал квантовую модель атома, заложившую теоретические основы всех спектральных методов. Позднее гипотеза квантов начала триумфально захватывать все новые и новые области науки и стала «царицей» современной физики, химии, биологии...

Квантовая теория учит нас, что если электрону любым способом сообщить достаточную энергию, то он перейдет на более высокий энергетический уровень и через 10^–13 с вернется в исходное основное состояние, испустив при этом фотон. Именно этим обусловлено свечение раскаленного металла, «холодная» флюоресценция светляков, в которых электроны возбуждаются за счет энергии расщепления АТФ – главного энергоносителя живой клетки, – и т. д. То же самое происходит и с электронами магния в хлорофилле, раствор которого долго еще после стояния на солнце испускает зеленый свет в темноте.
А из самых глубоких недр Солнца и звезд приходит к земному наблюдателю излучение, состоящее из неуловимых квантовых частиц, которые Энрико Ферми в свое время предложил называть нейтрино.
Раймонд Дэвис из Пенсильванского университета (США) заинтересовался средствами регистрации нейтрино – электрически нейтральной элементарной частицы с массой покоя много меньшей массы электрона и исчезающе малым (возможно, нулевым) магнитным моментом. Дэвис подошел к решению этой физической задачи с сугубо химических позиций: предположил, что небольшую энергетическую флуктуацию в виде всепроникающего нейтрино способна уловить сравнительно неустойчивая химическая система. Прежде всего возникала мысль о плавиковой кислоте HF, но очень уж она токсична и к тому же дорога. Поэтому было решено воспользоваться опытом химчистки, т. е. обратиться к тетрахлорэтилену. Достаточная по расчетам теоретиков масса реагента была помещена на глубине 600 м в заброшенной шахте, и за 30 лет (до 1994 г.) было зарегистрировано 2 тыс. вспышек вследствие захвата солнечных нейтрино.
23 февраля 1987 г. в Камиоканде (близ Токио) был запущен новый «нейтринный телескоп», состоявший из 3 тыс. тонн воды, способный улавливать нейтрино, пришедшие из Большого Магелланова облака, удаленного от Земли на 170 тыс. световых лет. В 1998 г. с помощью усовершенствованного «телескопа-детектора» там же впервые удалось определить и массу нейтрино!
Нейтрино из-за своей исчезающе малой массы покоя практически не взаимодействуют с любым веществом, чего не скажешь о мощных квантах рентгеновского излучения, которое, однако, «гасится» нашей атмосферой. Вот почему Риккардо Джиаконни из Ассоциированного университета в Вашингтоне предложил вывести рентгеновский телескоп на околоземную орбиту. С помощью этого телескопа была обнаружена первая «черная дыра», обладающая настолько сильным гравитационным полем, что из области ее пространства-времени почти невозможно вырваться какой-либо информации о физико-химических процессах, происходящих внутри нее.
Обратите внимание на то, что, подобно электронам и нейтрино, рентгеновские кванты могут быть поглощены атомами и молекулами. Это немаловажно для понимания изложенного ниже материала...
Клетки смертны, причем вопреки расхожей булгаковской фразе «внезапно смертны» в их геном заложены программы окончания жизненного пути, или цикла. Процесс реализации этих генетических программ сугубо химический. В норме в клетках есть особый белок АИФ – апоптоз-индуцирующий фактор^*, который защищает их от преждевременной смерти. При мутациях АИФ клетка просто переполняется пероксидом водорода Н₂О₂ – источником радикальных кислородных форм. К тому же небольшие количества белка АИФ не всегда способны справиться с агрессивными радикалами кислорода, убивающими чувствительные нервные клетки.
Исследования показали, что в клетках мышей уже с первого месяца жизни накапливаются липидные (жировые) пероксидные соединения, увеличивается каталазная активность (ферменты каталазы «перерабатывают» все тот же пероксид, не давая образовываться кислородным радикалам), повышается концентрация глютатиона, являющегося донором электронов при восстановлении H₂O₂, а также ферментов-антиоксидантов с оксидоредуктазной активностью. В ДНК резко возрастает количество окислительных повреждений, что приводит к образованию токсического для генетической молекулы гидроксидезоксигуанозина. Последний же является четким химическим «индикатором» окислительного стресса, испытываемого клетками.
Таким образом, сложный процесс апоптоза после двух десятилетий интенсивных исследований в конечном итоге свелся к «простейшей» химии. Так что если бы не клетки и не гены, то Нобелевскую премию 2002 г. за результаты исследований апоптоза небезосновательно могли бы вручить и по химии. Вручили же ее по физиологии и медицине Джону Салстону (королева Елизавета II за заслуги в науке посвятила его в 2001 г. в рыцари), американскому ученому Роберту Горвицу из Массачусетсского технологического института и Сиднею Бреннеру, который в свое время приехал в Кембридж из ЮАР и при участии которого в 2001 г. было завершено прочтение генома человека.
Прошло 40 лет после того, как Фрэнсис Крик, Джеймс Уотсон и Морис Уилкинс были приглашены в 1962 г. в Стокгольм для вручения им Нобелевской премии по физиологии и медицине за модель ДНК в виде двойной спирали (см. № 41/2002). Вместе с ними Нобелевскую премию по химии получали Макс Перутц и Джон Кендрю. Опираясь на созданный Джоном Берналом и его талантливой ученицей Дороти Кроуфут-Ходжкин специальный метод рентгеноструктурного анализа монокристаллов белков, Перутц и Кендрю сумели расшифровать пространственное строение молекул гемо- и миоглобина соответственно.
Сейчас даже трудно поверить, что на построение модели молекулы гемоглобина (рис. 1) Перутц потратил почти 25 лет!

Рис. 1. Схематичная модель молекулы гемоглобина (М.Ф.Перутц, 1960 г.)

Также трудно поверить, что он поначалу не одобрял увлечения Кендрю электронно-вычислительными машинами, отдав предпочтение логарифмической линейке. Неудивительно, что в 1960-х гг., да и позднее, когда разрешение в рентгеноструктурном анализе белков достигло 1, рентгенограммы протеинов нередко воспринимались как «откровение свыше».
Вместе с тем рентгеновское «просвечивание» белков обладает одним существенным недостатком. С помощью рентгеновских лучей можно плодотворно исследовать лишь те белки, которые кристаллизуются. Это крайне сужает область применимости метода рентгеноструктурного анализа, поскольку далеко не все белки (например, мембранные) способны кристаллизовываться. К тому же сам этот метод весьма трудоемок и дорог, что особенно хорошо известно специалистам по ядерной химии и физике...
Метод рентгеноструктурного анализа не позволяет зафиксировать мгновенное расположение белков. Если иметь в виду, что в клетке одновременно функционирует порядка 10 тыс. различных белков, которые находятся в постоянном динамическом взаимодействии (распадаются, объединяются и т. д.), то можно себе представить, как «замедляет» развитие молекулярной биологии и смежных наук стадия получения рентгеноструктурных данных. Поэтому ученые пытались ускорить исследовательский процесс, хотя бы с помощью определения масс протеиновых фрагментов.
Для выяснения молекулярной массы, структуры и состава соединения уже относительно давно изобретена масс-спектрометрия. Метод основан на ионизации молекул под действием потока электронов и др. Важно было «внедрить» масс-спектрометрию в область биоорганической химии. А для этого необходимо было научиться сосредоточивать достаточно малые белковые фрагменты.
Нобелевская премия 2002 г. по химии присуждена умудренному опытом 85-летнему Джону Фенну, придумавшему разгонять белковые «осколки» (фрагменты) в вакуумной камере, что резко повысило разрешение масс-спектрометрического метода.
«Юный» же 43-летний японский ученый Коичи Танака из лаборатории «Наука о жизни» Киотской корпорации точного машиностроения (солауреат Нобелевской премии 2002 г. по химии) осуществил фрагментацию белков с помощью лазера, сверхкороткий импульс которого «точечно» воздействовал на белковый раствор. Образовавшиеся при этом белковые фрагменты затем направлялись в масс-спектрометр.
И все-таки... Очень уж мало информации о структуре и функции протеина удается извлечь из масс-спектрометрических данных и его осколочных массах.
11 сентября 1992 г. будущий солауреат Нобелевской премии 2002 г. по химии Курт Вюртрих из Цюрихского института молекулярной биологии и биофизики опубликовал со своими коллегами статью в журнале «Science», в которой описал результаты применения метода ядерного магнитного резонанса (ЯМР) в исследованиях трехмерной пространственной структуры протеинов. В общем-то удивительно, что этот относительно «древний» метод (открыт в 1946 г., отмечен Нобелевской премией в 1952 г.) не попробовали «испытать» на белках раньше.

Рис. 2. Один из первых полипептидов, исследованных методом ЯМР (G53 –глицин, в центре – двойное кольцо боковой цепи триптофана, L60 – лейцин)

Вюртрих с коллегами исследовал тогда методом ЯМР довольно скромное, по нынешним меркам, белковое образование, содержащее всего 63 аминокислотных остатка (рис. 2). Обработка ЯМР-данных показала, что в условиях опыта четыре аминокислоты – два валина, триптофан и лейцин – в полном соответствии со своими химическими свойствами действительно образуют гидрофобный кластер («гроздь»).
Это была своего рода заявка на открытие. А все потому, что полипептид был изучен в растворе!
Стало ясно, что благодаря методу ЯМР все-таки можно «оторваться» от кристаллов, а это резко расширяло исследовательские горизонты. Хотя с помощью мочевины (7 М р-р) исследовавшийся полипептид удалось «развернуть» (денатурировать), однако присутствующий в нем гидрофобный кластер остался в нативном, т. е. естественном (природном), виде. Это был самый настоящий прорыв в области изучения пространственной структуры белков и соответственно их функции.
За десять прошедших лет необычайно расширились возможности метода ЯМР применительно к протеинам. Сейчас этим методом анализируют такие белки, подступиться к которым раньше и мечтать не приходилось.
Буквально накануне сообщения из Стокгольма о присуждении ему Нобелевской премии Вюртрих опубликовал в журнале «Nature» результаты ЯМР-анализа бактериального белка массой 900 килодальтон! Этот протеин привлекает особое внимание ученых, поскольку относится к так называемым шаперонам.
Белки-шапероны играют очень важную роль в клетке, поскольку обеспечивают правильное «складывание» молекул новосинтезируемых протеинов (рис. 3). Известно, что только правильно сложенный белок (как и парашют) может выполнить свою функцию. Разрушение природной (нативной) макроструктуры белка называется денатурацией (необратимую денатурацию мы каждый раз наблюдаем, готовя яичницу). Понять строение и механизм действия шаперонов крайне важно, поскольку денатурация белковых цепей сопряжена с разного рода болезнями.

Рис. 3. Белок-шаперон, внутренняя полость которого придает протеину требуемую пространственную структуру

Разнообразие методических возможностей изучения макроструктуры белка иллюстрируется также оригинальным примером из сообщения в одном из недавних номеров журнала «Nature». Сотрудники Национального института здоровья в Вашингтоне прикрепили к концам белковой цепи по молекуле флюоресцирующего красителя – зеленого к одному концу и красного к другому. В сложенном состоянии белка, образующемся при перекрещивании под углом 90° восьми -структур, расстояние между этими молекулами составляет около 1 нм (10^–9 м). Добавление химического денатурирующего агента (той же мочевины) приводит к развертыванию -структур, т. е. к денатурированной полипептидной цепи, в которой молекулы флюоресцирующих красителей разведены в пространстве.
Когда такой белок находится в нативном (свернутом) состоянии, импульсное сфокусированное лазерное излучение возбуждает электроны зеленого красителя, способного испускать «зеленые» фотоны, с короткой длиной волны (высокой частотой). Эти фотоны, беспрепятственно преодолев расстояние в 1 нм до красного красителя, захватываются и трансформируются в фотоны «красные», с большей длиной волны (меньшей частотой).
Неудивительно, что раствор с нативной укладкой такого белка после лазерного облучения «загорается» красным пламенем, подобно рубиновым звездам Кремля. Когда же макроструктура белка денатурирована (молекулы красителей разведены в пространстве), «зеленые» кванты не способны добраться до красного красителя и возбудить его электроны. По этой причине раствор зеленеет.
Описанный метод установления макроструктуры полипептидной цепи в растворе подкупающе прост и демонстративен. И кто знает, может быть, через 10 лет его создателя назовут в числе лауреатов самой престижной научной премии мира...

^*Апоптоз – от греч. аро (от) и (падение).

Материал подготовил
И.Э.ЛАЛАЯНЦ
(Nature, 2002, № 6894, р. 207;
№ 6908, р. 743; № 6905, р. 367)