Главная страница «Первого сентября» • Главная страница журнала «Химия» • Содержание №6/2003

Летопись важнейших открытий

Первый синтез
пептидного гормона – окситоцина

В 1953 г. американский ученый Винсент Дю Виньо совместно с сотрудниками выяснил строение окситоцина – циклического полипептида. Cреди известных природных соединений подобные циклические структуры ранее не встречались. В следующем году ученый впервые осуществил синтез этого вещества. Это был первый случай синтеза полипептидного гормона в условиях in vitro.

Дю Виньо известен в научном мире своими исследованиями на стыке химии и медицины. В середине 1920-х гг. предметом его научного интереса было изучение функции серы в инсулине – гормоне1 поджелудочной железы, регулирующем процесс углеводного обмена и поддержания нормального уровня сахара (глюкозы) в крови. Интерес молодого человека к химии инсулина зародился, по его воспоминаниям, после одной из лекций, прочитанных профессором Уильямом К.Розе сразу же после открытия этого вещества Фредериком Г.Бантингом2 и Джоном Дж.Р.Маклеодом. Поэтому, когда после окончания университета Джон Р.Мурлин из Рочестерского университета предложил ему заняться изучением химической природы инсулина, молодой ученый посчитал это предначертанным судьбой предложением. «Шанс поработать над химией инсулина перечеркнул все остальные мои научные ожидания, – отмечал впоследствии Дю Виньо, – поэтому я сразу же принял предложение профессора Мурлина».

Статья опубликована при поддержке компании "vivozmysora.ru". Компания предлагает услуги по вывозу мусора в Москве и Московской области, заказ контейнера. Доступные цены, приезд машины в указанное время, транспортировка отходов контейнерами 8-27 кубов, вывоз осуществляется в специализированные полигоны. Профессиональные водители с большим опытом, качественный сервис. Подробную информацию Вы сможете узнать на странице сайта компании.

За время работы в Рочестерском университете Дю Виньо удалось высказать первые предположения о химическом составе инсулина, которые в значительной степени были отражены в его диссертации «Сера инсулина», защищенной в 1927 г. Согласно воззрениям Дю Виньо инсулин являлся одним из производных аминокислоты цистина. Он идентифицировал инсулин как серосодержащее соединение, в котором серные фрагменты представляют собой дисульфидные мостики. Он высказал также соображения о пептидной3 природе инсулина.
Следует отметить, что данные Дю Виньо о том, что инсулин является серосодержащим соединением, хорошо согласовывались с основными выводами работ, проводимых в то время в этом направлении профессором Джоном Якобом Абелем с сотрудниками в университете Джона Хопкинса. Поэтому стипендия Национального исследовательского совета, которую молодой ученый получил сразу же после защиты диссертации, оказалась очень кстати. Благодаря ей Дю Виньо работал некоторое время под руководством профессора Абеля в медицинской школе университета Джона Хопкинса.
Профессор Абель, признанный авторитет в области изучения химии гормонов, придерживался в то время точки зрения, что инсулин является белковым соединением. Такие взгляды шли вразрез с доминировавшими в те годы представлениями. Как вспоминал сам Дю Виньо, «это было время, когда как химики, так и биологи никак не могли воспринять тот факт, что энзим может быть белковым соединением». Незадолго до этого профессор Абель смог впервые выделить инсулин в кристаллическом виде (1926). В планы Дю Виньо, когда он устроился на стажировку к Абелю, входило следующее: выделить из кристаллов инсулина аминокислоту цистин и попытаться изучить ее строение. Это ему очень быстро удалось осуществить. В результате исследований совместно с сотрудниками профессора и при его непосредственной помощи молодой ученый наглядно продемонстрировал образование ряда аминокислот при расщеплении молекулы инсулина. Одной из них была как раз серосодержащая аминокислота цистин. При этом опыты показали, что содержание серы в инсулине прямо соотносится с содержанием серы в цистине. Но достигнутые результаты требовали изучения других серосодержащих аминокислот.
Продолжение финансовой поддержки со стороны Национального исследовательского совета еще на один год позволило Дю Виньо посетить известные научные биохимические школы Западной Европы (Дрезден, Эдинбург, Лондон), там он смог получить дополнительный опыт в области изучения пептидов и аминокислот.
По возвращении в США ученый сначала работал в Иллинойском университете, а через три года перешел в медицинскую школу университета Джорджа Вашингтона. Здесь он продолжал свои исследования инсулина. Особенно интересными оказались его работы по изучению влияния дисульфидных связей в цистине на гипогликемический эффект инсулина (понижения сахара в крови). Работы в области инсулина стимулировали также новое направление исследований – изучение гормонов гипофиза4.
Важным направлением его работ в университете Джорджа Вашингтона стало изучение механизма конверсии метионина в цистин в живых организмах. В последующие годы именно эти исследования подвели его к проблеме изучения биологического трансметилирования (переноса метильных групп от одной молекулы на другие).
В 1938 г. ученый был приглашен в Медицинский колледж Корнеллского университета. Здесь он продолжил изучение инсулина и развернул исследования по изучению гормонов задней доли гипофизной железы.
В годы второй мировой войны эти исследования пришлось на время прервать. Ученый со своими сотрудниками работал над синтезом пенициллина. По окончании войны Дю Виньо смог вернуться к прежним исследованиям. Особенно интенсивно он занялся работами по выделению ряда гормонов из коммерчески доступных экстрактов гипофиза и тканей гипофиза быка и свиньи.
Задняя доля гипофизной железы вырабатывает ряд гормонов, два из которых к тому времени были выделены в чистом виде. Один из них – окситоцин, стимулирующий гладкую мускулатуру матки, другой – вазопрессин – гормон, сокращающий периферические артериолы и капилляры, тем самым обусловливая повышение давления крови. Эти гормоны, как оказалось, очень трудно различать, т. к. они обладают сходными физическими свойствами. Именно из-за этого до середины 1920-х гг. медики и биохимики считали их одним веществом, обладающим широким спектром биологической активности. Благодаря совершенствованию методов химического анализа, в
частности фракционного осаждения, хроматографии и электрофореза, к 1940-м гг. эти гормоны удалось частично разделить.
В 1949 г. Дю Виньо, применив метод «противоточного распределения» для продажного экстракта, имеющего окситоциновую активность 20 ед/мг, получил препарат с активностью 850 ед/мг. Это сподвигло ученого предпринять попытку изучить строение вещества. С этой целью он осуществил фрагментацию полипептидной цепи. В результате полного гидролиза препарата окситоцина и данных анализа его аминокислотного состава Дю Виньо было установлено наличие восьми различных аминокислот в эквимолекулярном соотношении. Количество выделившегося аммиака соответствовало трем амидным группам типа
–CONH2, молекулярная масса – мономерному октапептиду. Один из восьми аминокислотных остатков был идентифицирован как цистин. Опыты по окислению цистина в окситоцине показывали, что обнаруженный ранее Дю Виньо дисульфидный мостик в цистине является частью кольцевой системы окситоцина.
Последовательность восьми аминокислот в окситоцине была установлена Дю Виньо с сотрудниками окончательно лишь в 1953 г. Следует отметить, что параллельно группе Дю Виньо над теми же проблемами в Вене работал профессор Ганс Туппи (Венский университет), который также в 1953 г. независимо от Дю Виньо установил последовательность аминокислот в окситоцине, использовав в своей работе метод Сенгера5.
Дю Виньо шел несколько иным путем. Он и его сотрудники основывались главным образом не на анализе концевых аминокислот, а на идентификации компонентов большого числа низших пептидов. Они исследовали также реакцию окисленного окситоцина с бромной водой, в результате которой образовывались гептапептид и бромированный пептид. Изучение строения последнего показывало, что последовательность аминокислот в соответствующем дипептиде: цистин – тиразин (обозначения см. в таблице).
Далее динитрофенильным методом было установлено, что N-концевой аминокислотой в гептапептиде является изолейцин. По заключению Дю Виньо из этого вытекает, что N-концевая последовательность в окисленном окситоцине:

HO3S – цис – тир – изл.

Аминокислоты из гормона окситоцина

Из тринадцати перечисленных ниже пептидов первые четыре были получены частичным гидролизом гептапептида, вторая группа – гидролизом окситоцина (при этом цистеиновые остатки превращались в остатки аланина). Затем отделяли нейтральную фракцию и обрабатывали бромной водой для окисления цистеинового звена в звено цистеиновой кислоты; полученный кислый пептид отделяли от нейтрального на ионнообменных смолах. Третья группа пептидов была получена гидролизом окситоцина, десульфированного на никеле Ренея. В приводимых ниже формулах, если последовательность аминокислот в пептидах известна, символы аминокислот разделены тире; если последовательность неизвестна, то символы разделены запятой.

Из гептапептида:

1. (асп – цис – SO3H).
2. (цис – SO3H, про).
3. (цис – SO3H, про, лей).
4. (цис – SO3H, про, лей, гли).

Из окситоцина:

5. (лей, гли, про).
6. (тир, цис – S – S – цис, асп, глу, лей, изл).
7. (тир, цис – S – S – цис, асп, глу).
8. (цис – S – S – цис, асп, глу).
9. (цис – SO3H, асп, глу).

Из десульфированного окситоцина:

10. (ала, асп).
11. (ала, асп, глу).
12. (глу, изл).
13. (ала, асп, глу, лей, изл).

Учитывая строение полученных пептидов и используя наложение отдельных компонентов пептидов, Дю Виньо с сотрудниками вывел следующую последовательность аминокислот в окситоцине:

цистин – тиразин – изолейцин – глутамин – NH2 – аспарагин – NH2 – цистин – пролин – лейцин – глицин – NH2.

Установленная ими структура окситоцина представлена на рис. 1.

Рис.1. Структура окситоцина, определенная Дю Виньо с сотрудниками
Рис.1.
Структура окситоцина, определенная Дю Виньо с сотрудниками

Следует отметить, что одновременно с окситоцином Дю Виньо была определена структура другого гормона задней доли гипофиза – вазопрессина.
Структура гормона окситоцина была подтверждена его химическим синтезом в 1954 г., что являло собой впервые осуществленный полный синтез природных пептидов. Синтез включал конденсацию N-карбобензокси-S-бензилдипептида (I) с триамидом гептапептида (II) с помощью тетраэтилпирофосфита. После удаления карбобензокси- и бензильных групп, защищавших амино- и сульфгидрильные группы соответственно в обоих пептидах, образовавшийся нонапептид окисляли воздухом, в результате чего был получен окситоцин (рис. 2).
Так были осуществлены первый структурный анализ и первый синтез полипептидного гормона – выдающееся достижение в биохимии и медицине. С работ Дю Виньо в науке началась эра химического синтеза биологически активных природных пептидов.

Рис.2. Общая схема синтеза окситоцина по Дю Виньо
Рис.2.
Общая схема синтеза окситоцина по Дю Виньо

Как известно, в 1955 г. Дю Виньо была вручена Нобелевская премия по химии «за работу с биологически активными соединениями, и прежде всего за впервые осуществленный синтез полипептидного гормона».

1Согласно классической точке зрения гормоны – это биологически активные вещества – регуляторы эндогенного происхождения, т. е. синтезируемые в организме, а не вносимые извне. Химическая природа гормонов различна. Это белки, пептиды, производные аминокислот, стероиды, липиды.
2В 1922 г. Ф.Бантинг с сотрудниками впервые выделил инсулин в чистом виде.
3Пептиды – органические природные или синтетические вещества, молекулы которых построены из остатков a-аминокислот, соединенных между собой пептидными связями С(О)–NH. По числу этих остатков различают дипептиды, трипептиды и т. д. Пептиды с длинной цепью называют полипептидами.
4Гипофиз – центральная железа внутренней секреции. Железы внутренней секреции выделяют продукты своего обмена в кровь.
5В полипептидной цепи белка с одной стороны расположен аминокислотный остаток, несущий свободную a-аминогруппу (амино- или N-концевой остаток), а с другой – остаток со свободной a-карбоксильной группой (карбоксильный или С-концевой остаток). Анализ концевых остатков играет важную роль в процессе определения аминокислотной последовательности белка. Например, на первом этапе исследования он дает возможность оценить число полипептидных цепей, составляющих молекулу белка, и степень гомогенности исследуемого препарата. Первый метод идентификации концевых аминогрупп в пептидах (динитрофторбензильный метод) был разработан Фредериком Сенгером в 1945 г.

ЛИТЕРАТУРА

Plane R. Interview with Vincent du Vigneaud. Journal of Сhemical Education, 1976, v. 53, №1, p. 8–12;
Du Vigneaud V. A Trail of Research in Sulfur Chemistry and Metabolism and Related Fields. Ithaca, New York: Cornell University Press, 1952;
Bing F. Vincent du Vigneaud. Journal of Nutrition, 1982, v. 112, p. 1465–1473;
Du Vigneaud V., Melville D.B., Gyo..rgy P., Rose K.S. Identity of Vitamin H with Biotin. Science, 1940, v. 92, p. 62–63; Лауреаты Нобелевской премии. Энциклопедия. Пер. с англ. Т. 2. М.: Прогресс, 1992.

* * *

ДЮ ВИНЬО Винсент (18.V.1901 – 11.XII.1978) родился в Чикаго (штат Иллинойс). Его отец, Альфред Дж. Дю Виньо, был изобретателем, инженером-конструктором. Интерес к естественным наукам у мальчика проявился достаточно рано. Уже в школьные годы он ставил в домашней лаборатории одного из своих товарищей опыты по химии и физике.
В 1918 г. Винсент при финансовой поддержке своей сестры Беатрис начал обучение в Иллинойсском университете по специальности «инженерная химия». Но вскоре предметом его интереса стала органическая химия, а затем биохимия (под влиянием Г.Б.Льюиса). В 1923 г. молодой человек получил степень бакалавра (руководитель – профессор К.С.Марвел), а в следующем году – степень магистра по химии, выполнив работу, посвященную синтезу одного из лекарственных соединений, обладающего местным анестезирующим и вазопрессорным (вызывающим повышение кровяного давления) действием.
Следует отметить, что годы обучения в университете для Винсента оказались нелегкими в финансовом плане. Параллельно с учебой ему пришлось много работать: сначала в качестве официанта, затем инструктора лейтенантов в кавалерийском резерве военных служб США. Обучая лейтенантов, он познакомился с английским майором, молодой девушкой по имени Зелла Зон Форд, которая по окончании университета стала женой Дю Виньо. Под влиянием своего будущего супруга Зелла посещала курсы математики и химии. Поэтому в первые годы замужества она работала преподавателем естественных наук. Впоследствии у супругов родились дочь Мэрилин и сын Винсент, ставший врачом.
Сразу по окончании университета Дю Виньо предпринял несколько попыток устроиться в какую-нибудь фармацевтическую компанию, ведь его научным интересом на всю жизнь стало, как он позднее называл, «изучение взаимосвязей между химической структурой органических соединений и их биологической активностью». Но в начале из этого ничего не получилось, и молодой ученый в течение полугода проработал в аналитической лаборатории компании «Du Pont». Затем при поддержке своего бывшего научного руководителя доктора Марвела ему удалось устроиться в филадельфийский военный госпиталь. В госпитале Дю Виньо наконец смог вести научные исследования в области клинической химии и одновременно начать преподавательскую работу в медицинской школе при Пенсильванском университете. Одновременно существовала возможность поступления в аспирантуру этого университета. Но весной 1925 г. молодой ученый неожиданно получил заманчивое предложение от профессора Дж.Р.Мурлина – заняться химией инсулина в только что открывшейся медицинской школе Рочестерского университета. Важную роль в этом сыграли рекомендации его бывших университетских наставников профессоров Льюиса и Марвела.
В 1927 г. ученый получил в Рочестерском университете докторскую степень по химии.
В 1928 г. он отправился в Германию, в Дрезден, в лабораторию профессора Макса Бергмана (ученика Эмиля Фишера), в то время уже признанного авторитета в области химии аминокислот и пептидов. У него Дю Виньо стажировался в области синтеза пептидов. Результаты исследований Дю Виньо понравились М.Бергману, и он предложил молодому стажеру стать его ассистентом. Но Дю Виньо, отклонив заманчивое предложение, направился на стажировку в Шотландию, в Эдинбургский университет, к профессору медицинской химии Джорджу Баргеру, а затем в клинику Лондонского университета к профессору Ч.Р.Харрингтону.
Через некоторое время пришлось подумать о возвращении на родину и о том, чтобы занять постоянную работу в каком-либо университете. Разослав письма с предложением своей кандидатуры в штат ряда университетов, Дю Виньо вскоре получил сразу несколько предложений. Он так вспоминал об этом поворотном этапе в своей жизни: «Я получил одно предложение
а) от профессора Мурлина из Рочестера, б) от профессора Абеля с фармацевтического факультета университета Джона Хопкинса,
в) место в Пенсильванском университете и, наконец, г) место в Нью-Йорке по клинической химии. В дополнение к этому пришло также предложение из Иллинойса от профессора Розе и Роджера Адамса, предлагавших место на факультете физиологической химии. В это время я уже твердо знал, что хочу быть биохимиком, при этом я хочу совмещать исследовательскую работу с преподавательской в области биохимии. Поэтому я принял предложение из Иллинойса, хотя в денежном эквиваленте оно не удовлетворяло моим запросам».
В Иллинойсе ученый проработал три года, и очень успешно. Но затем последовало предложение из медицинской школы университета Джорджа Вашингтона (штат Вашингтон), где Дю Виньо сразу же получил должность профессора и возглавил биохимический факультет. В новый университет за ним последовали также многие исследователи из его рабочей группы. Здесь ученый продолжил свои исследования инсулина и частично цистина. Важным направлением его деятельности в университета Джорджа Вашингтона были также начатые им исследования в области химии биотина.
В 1920-х – начале 1930-х гг. многие исследователи отмечали, что крысы, питавшиеся только яичным белком и не получавшие других белков, имели некоторые неврологические проблемы, кроме того, у них значительно ухудшалось состояние их кожных покровов. Сбалансированная диета разрешала эти проблемы. Витамин, которого так не хватало крысам в первой диете, назвали витамином Н. Известный биохимик Поль Джорджи (Paul Gyo..rgy) обратился к Дю Виньо с просьбой идентифицировать это вещество. В 1936 г. похожее вещество неожиданно было изолировано другими исследователями и идентифицировано как производное биотина (серосодержащего вещества, необходимого для деления клеток дрожжей). Последовательные эксперименты Дю Виньо в этом направлении показали, что выделяемый из ткани печени и молока биотин является коферментом. Он принимает участие в клеточном дыхании, причем идентичен по структуре и свойствам веществу, известному как витамин Н. Биотин сразу же был добавлен в список жизненно важных витаминов группы В. Как оказалось, в яйцах существует белок авидин, который плотно связывается с биотином и таким образом препятствует его усвоению живыми организмами.
В университете Джорджа Вашингтона важным направлением работы Дю Виньо было также создание новой учебной программы по биохимии для студентов-медиков.
С 1938 г. научная деятельность ученого переместилась в стены Корнеллского университета в Нью-Йорке, куда он был приглашен на должность профессора биохимии и декана биохимического факультета медицинского колледжа. Этот медицинский центр стал для него настоящим научным домом на оставшееся время академической карьеры. Сюда он взял с собой в штат пять сотрудников из университета Джорджа Вашингтона для продолжения исследований. В своих воспоминаниях ученый отмечал, что каждый раз, переезжая из одного университета в другой, он брал с собой сотрудников со старого места работы, по его образному выражению, «это как пересадка дерева – она должна быть обязательно с кусочком земли из старого места».
Именно в Корнеллском университете ученый осуществил свою наиболее признанную научной общественностью работу по определению структуры и синтезу окситоцина. Синтезированный им гормон был успешно испытан в клинических условиях на женщинах для стимуляции родов. Дальнейшие исследования в области биологически активных гормонов он проводил для установления возможностей замещения одних аминокислот на другие в ряде исследованных им структур. Параллельно он продолжал изучать биотин, метаболизм аминокислот и др.
Работа ученого в Корнеллском университете была отмечена самыми высокими наградами: медалью Николса Американского химического общества (1945), премией Бордена по медицинским наукам, премиями Осборна и Менделя Американского института питания (1953), медалью Чарльза Фредерика Чендлера Колумбийского университета (1956), медалью Уилларда Гиббса (1956) и Нобелевской премией.
С 1967 по 1975 г. ученый был профессором химии Корнеллского университета в Итаке. Дю Виньо также являлся членом советов Рокфеллерского института медицинских исследований, Национального института артрита и метаболических болезней и Исследовательского института здоровья в Нью-Йорке, президентом Гарвеевского общества, Американского общества биологической химии и председателем совета Федерации американских обществ экспериментальной биологии.

Е.А.ЗАЙЦЕВА

Рейтинг@Mail.ru