Летопись важнейших открытий

Открытие полинуклеотидфосфорилазы –
ключ к расшифровке генетического кода

В 1955 г. Северо Очоа выделил бактериальный фермент полинуклеотидфосфорилазу,
с помощью которого он получил синтетические рибонуклеиновые кислоты (РНК)
с различным составом азотистых оснований. Это достижение стало ключом
к расшифровке генетического кода.

Основным направлением исследований американского биохимика С.Очоа в 1940–1950-е гг. было изучение биохимических реакций, в которых углеводы и жирные кислоты образуют энергию для клеточных процессов. Как известно, основными источниками клеточной энергии являются вещества, содержащие фосфат в виде аденозинтрифосфата (АТФ). Аминокислоты, жиры и углеводы метаболизируются¹ в цикле лимонной кислоты (цикл Кребса)², т. е. в цепи реакций, приводящей к образованию АТФ.
В начале 1950-х гг. Очоа занимался как раз исследованием ферментов, связанных с основными механизмами обмена веществ. Ученый, в частности, обнаружил, что полное окисление одной молекулы глюкозы до двуоксида углерода дает 36 молекул АТФ, богатых энергией. Он также объяснил механизм цикла лимонной кислоты, выделив впервые ферменты, известные под названием цитратсинтетаза, изоцитратдегидрогеназа, и фермент яблочной кислоты.
Фермент полинуклеотидфосфорилаза был открыт при исследовании одной из реакций биологического фосфорилирования. Целью работы, проводимой в середине 1950-х гг. Очоа и французской исследовательницей М.Грюнберг-Манаго, было изучение включения радиоактивного ортофосфата в аденозинтрифосфат с помощью растворимой энзиматической системы в качестве катализатора. Грюнберг-Манаго приехала в то время на стажировку в лабораторию Очоа.
В аморфном препарате АТФ, который применялся для исследований, как оказалось, присутствовала примесь аденозиндифосфата (АДФ). Очоа и Грюнберг-Манаго установили, что сырые бактериальные экстракты Azotobacter vinilandi с АТФ содержат аденилаткиназу – фермент, который катализировал обратимую реакцию превращения АТФ в АДФ. В результате исследователями отмечалось одновременное быстрое включение меченого ортофосфата не только в АТФ, но и в АДФ. Чтобы исключить влияние АДФ, были поставлены «чистые» эксперименты с энзиматическими системами, освобожденными от аденилаткиназы. В этих случаях интенсивность «обмена» ортофосфата резко снижалась. Тогда были испытаны чистые препараты АДФ, лишенные всевозможных примесей. Оказалось, что реакция обмена между ортофосфатом и АДФ протекает особенно активно. Этот факт дал возможность группе Очоа прийти к выводу, что в исследуемом бактериальном экстракте присутствует неизвестный ранее фермент, катализирующий включение радиоактивной метки преимущественно в АДФ.
Одновременно было обнаружено, что реакционная смесь становится вязкой. Дальнейшие эксперименты показали, что нарастание вязкости связано с образованием полимерного продукта, осаждаемого трихлоруксусной кислотой и спиртом. Очоа было также выявлено, что обработка нуклеазами приводит к разжижению реакционной смеси. При исследовании гидролизата с помощью методов хроматографии на бумаге и абсорбционной спектрофотометрии ученому удалось обнаружить продукты гидролиза рибонуклеиновой кислоты. Стало очевидно, что получаемый в экспериментах полимер – структурный аналог рибонуклеиновой кислоты и что в бактериальном экстракте протекает неизвестная ранее реакция.
Очоа и Грюнберг-Манаго выделили катализирующий ее фермент и установили, что реакция происходит по следующему механизму:

По аналогии с известным ферментом углеводного обмена – фосфорилазой крахмала – новый фермент был назван полинуклеотидфосфорилазой.
Для утверждения факта открытия нового фермента потребовался поток публикаций в наиболее престижных изданиях в течение 1955–1956 гг.
Широко образованный и ориентированный во многих областях биологии и химии, Очоа быстро оценил значимость этого наблюдения и направил усилия всей лаборатории на выполнение радикально измененной исследовательской программы. В нее входили следующие проблемы: является ли реакция, катализиру-
емая полинуклеотидфосфорилазой, основным механизмом синтеза РНК, можно ли с помощью подобного процесса осуществить синтез ДНК, проявляют ли искусственные РНК-подобные полимеры такие биологические свойства, как влияние на белковый синтез и проч.
В процессе последующих исследований оказалось, что этот фермент ответственен за синтез рибонуклеиновой кислоты. В 1955 г. с его помощью был осуществлен синтез РНК, аналогичной по своим свойствам природной.

К истории вопроса расшифровки генетического кода

К двадцатым годам прошлого столетия было установлено, что передачей наследственных признаков ведают хромосомы, состоящие из нуклеиновых кислот и белка. Позднее химики установили, что нуклеиновые кислоты и белки – это высокомолекулярные соединения, длинноцепочечные полимеры.
В 1944 г. стало известно, что наследственность находит свое вещественное или физическое выражение в молекулярных структурах нуклеиновых кислот. Наследственную информацию, зашифрованную в хромосомах, определяет расположение атомов в молекулах дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Это установил американский бактериолог О.Эвери, который показал экспериментально, что наследственные признаки могут быть переданы от одной бактериальной клетки к другой при помощи очищенного препарата ДНК. Поскольку ДНК были обнаружены в хромосомах всех клеток, опыты Эвери указывали на то, что все гены состоят из ДНК. Таким образом, выяснение химического строения этих молекул могло стать важным шагом к пониманию того, как воспроизводятся гены.
Следует заметить, что способ образования ДНК в клетках был в то время одной из центральных проблем биологии и генетики, ею занимались одновременно ученые многих стран мира. Открытие структуры ДНК в 1953 г. (Нобелевская премия по физиологии и медицине в 1962 г. за это открытие была присуждена американскому ученому Дж.Уотсону и английским ученым Ф.Крику и М.Уилкинсу – об этом см.: «Химия», 2002, № 41) произвело настоящий переворот в биохимии и повлекло за собой огромное количество новых исследований и в других областях науки.
С помощью трехмерной модели, созданной Уотсоном и Криком, ученые смогли наконец исследовать биосинтез ДНК. Как известно, Уотсон и Крик обнаружили, что молекула ДНК свернута в двойную спираль наподобие винтовой лестницы. Снаружи этой спирали располагаются два слоя дезоксирибозы (пятиатомный углевод), соединенные фосфатными мостиками. Эти два слоя внутри спирали объединены парами азотистых оснований («ступеньки лестницы»), соединенными друг с другом водородными связями. Оказалось, что обе половины молекулы ДНК сначала отделяются друг от друга наподобие застежки «молнии». Далее рядом с каждой такой половиной синтезируется ее зеркальное отображение. Последовательность азотистых оснований, или нуклеотидов (один из компонентов, на которые расщепляется ДНК под действием нуклеаз), служит матрицей для синтеза новых молекул.
Таким образом, было показано, что гены, расположенные в хромосомах ядра каждой клетки, определяют наследование физических признаков и управляют синтезом белков (ферментов). Они состоят из участков молекулы ДНК, содержащей азотистые основания (пуриновые или пиримидиновые), расположенные вместе с моносахаридами и фосфатными группами в виде двойной спирали. Выяснение функций ДНК как хранителя наследственной информации вплотную поставило вопрос о генетическом коде.
Первая «грамматика» языка наследственности была предложена в 1954 г. физиком Г.Гамовым³. Это был так называемый триплетный вырожденный перекрывающийся код⁴. Ученый предположил, что для кодирования одной аминокислоты необходимо сочетание трех нуклеотидов. При этом в схеме Гамова кодовые «слова», именуемые «кодонами», различаются только по составу нуклеотидов, входящих в «слово», но не порядком их расположения. В 1957 г. А.Н.Белозерский и А.С.Спирин предсказали существование информационной РНК.
Синтез белков происходит при передаче генетической информации рибонуклеиновой кислоте, сходной по своей структуре с ДНК. Но РНК отличается от ДНК тем, что имеет лишнюю гидроксильную группу (содержит вместо моносахарида дезоксирибозы рибозу), а азотистое основание тимин заменено очень близким ему по структуре урацилом. В принципе РНК может образовывать двойные спирали и выполнять наследственные функции подобно ДНК. Но в большинстве организмов свои основные функции РНК выполняет в виде однонитевых молекул. Три вида РНК участвуют в последовательном включении аминокислот в молекулу белка: информационная, рибосомная и транспортная. Благодаря тем же свойствам комплементарности (взаимное соответствие в химическом строении двух макромолекул) оснований РНК снимает копии, или «рабочие шаблоны», с молекул ДНК, хранящихся в клеточном ядре.
Таким образом, к 1957 г. было установлено, что генетические инструкции для синтеза белка закодированы в последовательности азотистых оснований ДНК и РНК. Группы из трех азотистых оснований, или триплеты, кодируют включение каждой аминокислоты в молекулу белка.
Несколько лет спустя об этой ситуации в биохимии Уотсон писал: «Даже после того, как роль РНК в белковом синтезе в основном выяснилась, ученые не склонны были особенно оптимистически расценивать перспективы расшифровки генетического кода. Предполагали, что идентификация кодонов (для каждой отдельной аминокислоты) потребует точного выяснения как последовательности оснований в гене, так и последовательности аминокислот в белковом продукте гена».
«Отмычкой», с помощью которой началось быстрое «взламывание» кода, оказались полимеры, синтезированные с помощью фермента полинуклеотидфосфорилазы, открытой в 1955 г. Очоа с сотрудниками.

Нобелевская премия за открытие механизма
биологического синтеза РНК и ДНК

Итак, используя полинуклеотидфосфорилазу для синтеза РНК-подобных полимеров, содержащих всевозможные сочетания четырех видов нуклеотидов: А (аденин), Г (гуанин), Ц (цитозин) и У (урацил), – Очоа постепенно установил состав многих триплетов, кодирующих аминокислоты. Ему удалось расшифровать триплетный код для 11 аминокислот. Работы Очоа впервые реально показали универсальность генетического кода. Они стали основой для разработки методов и направлений репликации (повторение) генетического материала клетки.
В 1959 г. ученому была присуждена Нобелевская премия по физиологии и медицине. Он ее разделил с А.Корнбергом, работавшим у Очоа ассистентом в Нью-Йоркском университете (начало 1940-х гг.). За последующие годы Корнберг стал также признанным авторитетом в области биохимии ферментов. Ему удалось выделить и очистить фермент, отвечающий за синтез ДНК у бактерии Escherichia coli. Ученый назвал этот фермент ДНК-полимеразой. С его помощью Корнберг и его коллеги в 1957 г. смогли синтезировать ДНК, однако ее точной репликации помешали загрязнения смеси в пробирке. Поскольку последовательность нуклеотидов при этом оказалась нарушенной, полученная ДНК была биологически неактивной, т. е. не могла служить матрицей для синтеза других молекул ДНК.
Корнбергу и Очоа была присуждена Нобелевская премия по физиологии и медицине «за открытие механизмов биологического синтеза рибонуклеиновой и дезоксирибонуклеиновой кислот». На церемонии награждения, состоявшейся в Стокгольме, Очоа назвал Корнберга «своим лучшим студентом»⁵.
Так открытие полинуклеотидфосфорилазы в 1955 г. привело к важнейшему обобщению, выявившему скрытую сущность такого уникального биологического явления, как передача генетической информации.

Литература

Химические основы наследственности. Пер. с англ. Под ред. И.Л.Кнунянца, Б.Н.Сидорова. М.: Иностр. лит., 1963, 500 с.; Горизонты биохимии. Под ред. Л.А.Тумермана. Пер. с англ. М.: Иностр. лит., 1964, 120 с.

* * *

ОЧОА Северо (24.IX.1905 – 01.XI.1993) – американский биохимик, родился в Луарке (Испания) и являлся самым младшим сыном в семье судьи и бизнесмена Северо и Кармен (Алборноз) Очоа.
Начальное образование мальчик получил в Луарке, затем продолжил обучение в колледже в Малаге. В 1921 г. он получил степень бакалавра гуманитарных наук и поступил в медицинскую школу при Мадридском университете, которую окончил в 1929 г. с дипломом доктора медицины. В течение двух последующих лет, получив грант Испанского совета по научным исследованиям, он изучал биохимию и физиологию мышечной ткани, работая исследователем-ассистентом в Институте медицинских исследований кайзера Вильгельма (Гейдельберг, Германия). В 1931 г. ученый возвратился на родину и получил место преподавателя физиологии и биохимии в Мадридском университете. В том же году он женился на Кармен Гарсиа Кобиан, дочери испанского судьи. В 1932–1934 гг. Очоа стажировался в области энзимологии (ферменты и их функции) при Национальном институте медицинских исследований в Лондоне. Возвратившись в 1935 г. в Мадридский университет, он был назначен заведующим отделения физиологии Института медицинских исследований при этом университете.
В 1936 г. в Испании началась гражданская война, поэтому ученый вместе с семьей покинул страну.
Некоторое время Очоа работал в Институте медицинских исследований кайзера Вильгельма, затем – в Лаборатории биологии моря в Плимуте и медицинской школе Оксфордского университета (Англия). Основным направлением исследований ученого в это время стало изучение функций тиамина (витамин B1) и процессы метаболизма в живых организмах – биохимические реакции, в которых углеводы и жирные кислоты образуют энергию для клеточных процессов.
После начала второй мировой войны в 1941 г. Очоа эмигрирует в США и в 1956 г. получает американское гражданство. В начале 1940-х гг. ученый работал преподавателем и научным сотрудником в отделе фармакологии университета Дж.Вашингтона. Здесь он участвовал в совместных исследованиях с супругами К.Ф. и Г.Т.Кори, известными биохимиками, специалистами в области промежуточного метаболизма углеводов.
В дальнейшем научная судьба Очоа оказалась надолго связанной с медицинской школой университета Нью-Йорка, где он начал работать с 1945 г. сначала как ассистент профессора биохимии, но уже в 1946 г. возглавил в ней отдел фармакологии. В 1954 г. Очоа получил звание профессора университета и с этого года по 1974 г. возглавлял в нем отделение биохимии. В 1949 г. ученый некоторое время также работал приглашенным профессором биохимии в отделении Калифорнийского университета в Беркли.
Именно на 1940–1960-е гг. приходится пик научных открытий Очоа. В эти годы наиболее значительная часть исследований ученого была посвящена изучению ферментативных реакций метаболизма углеводов, роли коферментов в синтезе углеводов и ферментов при окислении жирных кислот.
После ухода в 1975 г. из университета на пенсию Очоа состоял в штате Института медицинских исследований в Нью-Джерси.
Среди наград и премий, присужденных Очоа, – медаль Карла Нойберга Американского общества европейских химиков (1951), премия Ш.Л.Майера Французского общества биохимиков (1955), премия Э.Бордена за медицинские исследования от Ассоциации американских медицинских колледжей (1958), орден Восходящего Солнца японского правительства (1967). Он был удостоен почетных степеней университетов Оксфордского (Великобритания), Пенсильванского, Мичиганского, а также университетов городов Вашингтона, Глазго и др.
Ученый являлся членом Американской ассоциации содействия развитию наук, Американской академии наук и искусств, Нью-Йоркской академии наук, Нью-Йоркской академии медицины, Американского общества биохимиков, Американского химического общества, Национальной академии наук США, Американского философского общества, Королевских академий наук Мадрида и Барселоны, Германской академии естествоиспытателей «Леопольдина». Он состоял также иностранным членом Лондонского королевского общества, Академии наук СССР и Польской академии наук.

¹Метаболизм – процессы в живых организмах.
²Цикл лимонной кислоты – цепь конечных химических реакций в клетках млекопитающих, в результате которых происходит окисление белков, жиров и углеводов в организме и образование энергии. Был открыт Х.Кребсом.
³Гамов Георгий Антонович (Джордж) (1904–1968) – американский физик-теоретик. Родился в России, в 1933 г. эмигрировал. С 1934 г. – профессор Университета Дж.Вашингтона (Вашингтон, США). Первым в мире сформулировал проблему генетического кода.
⁴Закодировать надо было 20 аминокислот. Одну и ту же кислоту могут кодировать несколько трехбуквенных (триплетных) «слов».
⁵Следует заметить, что впоследствии А.Корнберг с соавторами написал трехтомный труд, в котором он изложил свои размышления, касающиеся данного открытия («Reflections on Biochemistry»). В этом труде он собрал все публикации по данной тематике, принадлежавшие Очоа, собственные, а также совместные с коллегами.

Е.А.ЗАЙЦЕВА